Los ensayos de gotas de agua en aceite son útiles para la química analítica, la evolución enzimática y el análisis de células individuales, pero generalmente requieren microfluídica para formar las gotas. Aquí, describimos la emulsificación con plantilla de partículas, un enfoque libre de microfluídica para realizar ensayos de gotas.
Las reacciones realizadas en gotas monodispersadas permiten una mayor precisión y sensibilidad en comparación con las equivalentes realizadas a granel. Sin embargo, el requisito de los microfluídicos de formar gotas controladas impone una barrera a los no expertos, limitando su uso. Aquí, describimos la emulsificación con plantilla de partículas, un enfoque para generar gotas monodispersas sin microfluídica. Utilizando esferas de hidrogel de plantillas, encapsulamos muestras en gotas monodispersadas mediante vórtice simple. Demostramos el enfoque utilizándolo para realizar PCR digital sin microfluídica.
La microfluídica de gotas aprovecha la compartimentación en gotas de picolitros para aumentar la sensibilidad y la precisión de los ensayos en comparación con las reacciones a granel, y tiene numerosas aplicaciones en el cribado químico, la ingeniería de proteínas y la secuenciación de próxima generación1,2,3. Por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa de gotas digitales (ddPCR) ofrece una mayor precisión en comparación con la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa a granel (qPCR), con aplicaciones para la variación genética en cánceres, la detección de mutaciones causantes de enfermedades y el diagnóstico prenatal4,5,6. Sin embargo, un desafío de la microfluídica de gotas es el requisito de que los dispositivos microfluídicos dividan las muestras; mientras que la microfluídica permite un excelente control sobre las propiedades de las gotas, requieren experiencia especializada para construir y operar7,8. En consecuencia, los métodos basados en gotas se limitan en gran medida a laboratorios expertos o, en raras ocasiones, a aplicaciones en las que se dispone de un instrumento comercial9,10. Para ampliar el uso de ensayos de gotas, el requisito de instrumentación microfluídica especializada es un obstáculo que debe superarse.
En este artículo, describimos la emulsificación con plantilla de partículas (PTE), un método libre de microfluídica para realizar reacciones en gotas monodispersadas. En PTE, las partículas de plantillas envuelven la muestra en gotas en aceite portador mediante vórtice simple (Figura 1). A medida que el sistema se mezcla, la porción acuosa se fragmenta en gotas de tamaño reducido hasta que las gotas contienen partículas individuales, momento en el que no es posible una mayor fragmentación porque requiere romper las partículas. La muestra engullida rodea las partículas como una cáscara en las gotas, encapsulando así cualquier célula dispersa, reactivos o partes funcionales (Figura 1D). Por lo tanto, PTE no requiere equipo o experiencia para realizar reacciones de gotas más allá de un vórtice común. Además, la generación de gotas toma segundos en comparación con los minutos u horas con microfluídica, y la cantidad producida es proporcional al volumen del contenedor, no al tiempo de operación del dispositivo, lo que lo hace sumamente escalable. Estos beneficios hacen que la PTE sea ideal para realizar ensayos de gotas en una variedad de circunstancias en las que la microfluídica no es práctica. Aquí, demostramos PTE y lo usamos para realizar ddPCR.
Figura 1. Descripción general del proceso de emulsificación con plantilla de partículas. (A) Las partículas de plantillas se mezclan con reactivos. (B) El exceso de reactivos se elimina después de la centrifugación. (C) La adición de moléculas de plantilla ocurre antes de la adición de aceite. (D) El vórtice produce gotas que contienen una sola molécula de plantilla. (E) El termociclado y la imagen posteriores permiten el análisis digital de gotas de la plantilla objetivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
PTE utiliza partículas para encapsular muestras en gotas monodispersadas por vórtice. Además de su simplicidad y accesibilidad, PTE proporciona varios beneficios adicionales, incluido el permitir que se generen grandes volúmenes de gotas instantáneamente. Además, el proceso se puede llevar a cabo en un tubo aislado, evitando la necesidad de transferir muestras a dispositivos microfluídicos, agilizando el flujo de trabajo general y limitando las oportunidades de contaminación o pérdida de muestras. Las partículas de plantillas también proporcionan un medio para diseñar el contenido de las reacciones de gotas resultantes. Por ejemplo, el tamaño de partícula, la química y la humectabilidad se pueden diseñar para la captura de biomoléculas o células dirigidas, mientras que las partes funcionales como enzimas, activos o ácidos nucleicos, se pueden mostrar en partículas para facilitar las reacciones, como para la secuenciación de células individuales o la caracterización funcional. Si bien el enfoque es flexible, existen importantes limitaciones para su uso. Por ejemplo, actualmente no es posible realizar adiciones de gotas como a menudo se realizan con microfluídica, lo que requiere que todos los componentes de reacción se introduzcan antes de la encapsulación; esto requiere que los reactivos sean compatibles y estables hasta que se puedan generar las gotas y, en el caso de combinaciones problemáticas, a menudo se puede abordar mezclando y emulsionando rápidamente la muestra en hielo. Alternativamente, se pueden utilizar componentes reactivos que se pueden activar externamente con luz o calor13. Por lo tanto, PTE proporciona un método flexible y escalable para realizar ensayos de gotas accesibles para no expertos. Esto, junto con su simplicidad y flexibilidad innatas, hace que PTE sea ideal para la ejecución y el desarrollo de numerosas aplicaciones de gotas.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo de desarrollo de este protocolo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R01-EB019453-02), la Oficina del Director de Inteligencia Nacional, la Actividad de Proyectos de Investigación Avanzada de Inteligencia a través de Raytheon BBN Technologies Corp (N66001-18-C-4507), el Programa de Investigadores de Biohub Chan-Zuckerberg, la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa a través de la Universidad de Texas A& M (W911NF1920013) y los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades a través de la Universidad Johns Hopkins Aplicada Laboratorio de Física (75D30-11-9C-06818 (CDC3)). Las opiniones y conclusiones contenidas en este documento son las de los autores y no deben interpretarse como que representan necesariamente las políticas oficiales, ya sean expresas o implícitas, de las organizaciones anteriores o del Gobierno de los Estados Unidos. El Gobierno de los Estados Unidos está autorizado a reproducir y distribuir reimpresiones con fines gubernamentales a pesar de cualquier anotación de derechos de autor en las mismas.
0.22 um syringe filter | Milipore Sigma | SLGP033RS | |
0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | |
0.75 mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
1 mL syringes | BD | 309628 | |
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) | Sigma-Aldrich | 370533 | |
1M Tris-HCI, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15568025 | |
27 gauge needles | BD | 305109 | |
3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
3D-printed centrifuge syringe holder | (custom) | (custom) | |
Acrylamide solution,40%, for electrophoresis, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A4058-100ML | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
Aquapel (fluorinated surface treatment) | Pittsburgh Glass Works | 47100 | |
Hexane | Sigma-Aldrich | 139386 | |
FC-40 fluorinated oil | Sigma-Aldrich | F9755 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | |
N,N′-Methylenebis(acrylamide) | Sigma-Aldrich | 146072-100G | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Novec-7500 Engineering Fluid (HFE oil) | 3M | 98-0212-2928-5 | |
polyethylene tubing | Scientific Commodities | B31695-PE/2 | |
fluorosurfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant | |
PGMEA developer | Sigma-Aldrich | 484431 | |
Photomasks | CadArt Servcies | (custom) | |
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
Spin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
Span 80 (sorbitane monooleate) | Sigma-Aldrich | s6760 | |
SU-8 3025 photoresist | Kayaku | 17030192 | |
Triton X-100 (octylphenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | t8787 | |
Tween 20 (polysorbate 20) | Sigma-Aldrich | p2287 | |
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
Yeast FWD | IDT | 5′-GCAGACCAGACCAGAACAAA-3′ | |
Yeast REV | IDT | 5′-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA AC-3 |
|
Yeast Probe | IDT | 5′-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk FQ/-3′ |
|
EVOS FL AUTO | Life Technologies | ||
EVOS LED Cube, GFP | Life Technologies | AMEP4651 | |
SYLGARD 184 KIT 1.1 LB (PDMS base and curing reagents) | Dow Corning | DC4019862 | |
TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
Saccharomyces cerevisiae genomic DNA | Milipore | 69240-3 | |
Expanded plasma cleaner (plasma bonder) | Harrick Plasma | PDC-002 (230V) |