תחליב בתבנית חלקיקים מאפשר בדיקות טיפות נטולות מיקרופלואידים

1. הכנת חלקיקי הידרוג’ל לתליית חלקיקים בתבנית חלקיקים. חלקיקי הידרוג’ל המשמשים תחליב תבנית חלקיקים ניתן להכין באמצעות שתי שיטות שונות. הכנה באמצעות חלקיקים זמינים מסחרית יש להוסיף 0.5 גרם חלקיקי פוליאקרילמיד מיובשים התואמים ל-PTE (למשל, ג’ל ביו-ג’ל P-60 (Bio-Rad), בקוטר 45-90 מיקרומטר) ל-30 מ”ל של מים סטריליים בצינור חרוטי של 50 מ”ל ומערבבים היטב. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. הכנה באמצעות ייצור מיקרופלואידי של חלקיקיםהערה: חלקיקי Polyacrylamide התואמים PTE ניתן להכין באמצעות יצרני טיפה זמינים מסחרית (למשל, QX200 טיפה Generator (Bio-Rad), RayDrop (Fluigent) וכו ‘), או על ידי עיצוב microfluidic מותאם אישית.ייצור מאסטר מותאם אישית עצב מסיכת פוטוליתוגרפיה רכה באמצעות תוכנת עיצוב (CAD) בעזרת מחשב. הדפס את מסכת הצילום ברזולוציה של 10 מיקרומטר בסרט מעגלים. יוצקים 1 מ”ל של פוטוארסיסט על מרכז של 3 רקיק סיליקון. השתמש מעיל ספין כדי ליצור שכבה 50 מיקרומטר של photoresist על ידי ספינינג זה ב 500 סל”ד במשך 30 שניות ואחריו 1250 סל”ד במשך 30 שניות. מניחים את הוופל על פלטה חמה להגדיר ל 95 °C (5 °F) במשך 15 דקות כדי לאדות את הממס. אבטחו את מסכת הצילום על רקיק הסיליקון עם מגלשת זכוכית כיסוי וחשפו את הוופל תחת 190 mW קולימי, 365 מיקרומטר UV LED למשך 2.5 דקות. מניחים את הוופל על פלטה חמה להגדיר ל 95 °C (5 דקות) עבור אפייה לאחר חשיפה. לפתח את רקיק סיליקון פוטורסיסט על ידי טבילתו באמבטיה של 100% פרופילן גליקול מונומתיל אתר אצטט (PGMEA) עד 15 דקות. יש לשטוף את הוופל עם 100% PGMEA טרי ואחריו 100% איזופרופנול. אוויר יבש את הוופל. הסר כל איזופרופנול שיורית על ידי ייבוש הוופל על פלטה חמה להגדיר ל 95 °C (70 °F) במשך 1 דקות. מניחים את הוופל לתוך 3 נקי בצלחת פטרי. ייצור של המכשיר המיקרופלואידי המותאם אישית מערבבים את בסיס הסיליקון polydimethylsiloxane (PDMS) ומרפאים ריאגנט ביחס של 10:1 במסה. Degas PDMS מעורב באמצעות חיטוי תחת ואקום הבית עד אין בועות אוויר ניתן לצפות. יוצקים את PDMS מנודה על המאסטר בצלחת פטרי, להבטיח את רקיק הסיליקון הוא שקוע לחלוטין. Degas את רקיק הסיליקון ו PDMS כדי להסיר את כל בועות אוויר שאולי נוצרו במהלך לשפוך. לרפא את PDMS על ידי הצבת רקיק סיליקון ו- PDMS בתנור להגדיר 65 °C לפחות 60 דקות. Excise בלוק של PDMS המכיל את התכונות microfluidic מצלחת פטרי באמצעות אזמל. יש להקפיד במיוחד כדי להימנע מפגיעה בתכונות הקיימות באדון הסיליקון. חבט את הכניסות ואת השקעים לתוך בלוק PDMS המתאים מכניסות ושקעים במכשיר microfluidic באמצעות אגרוף ביופסיה 0.75 מ”מ. הסר כל אבק וחלקיקים עם היישום החוזר והסרה של סרט אריזה אל פני השטח של בלוק PDMS. נקה מגלשת זכוכית 50 מ”מ x 75 מ”מ על ידי שטיפה עם 100% איזופרופנול ולאחר מכן ייבוש אוויר על פני השטח. פלזמה לטפל הן שקופית זכוכית PDMS (תכונות מול למעלה) באמצעות 1 mbar של פלזמה O2 במשך 1 דקות באמצעות bonder פלזמה. הצמד את ה- PDMS למגלשת הזכוכית על ידי הצבת PDMS שטופלו בפלזמה עם תכונות הפונות כלפי מטה אל מגלשת הזכוכית, צד מטופל בפלזמה הפונה כלפי מעלה. מניחים את השקופית לתוך תנור להגדיר ל 65 °C (65 °F) לפחות 30 דקות כדי להשלים את מליטה. לטפל בכל הערוצים microfluidic עם טיפול פני השטח פלואורין כדי להבטיח הידרופוביה פני השטח ולמנוע הרטבה. אופים את המכשיר ב 65 °C (65 °F) לפחות 10 דקות. ייצור של חלקיקים טמפלטינג הכן פתרון פוליאקרילמיד (PAA) המורכב מ-6.2% אקרילאמיד, 0.18% N,N′-מתילנדים (אקרילאמיד) ו-0.3% אמוניום אסולפט. לטעון פתרון זה לתוך מזרק 1 מ”ל עם מחט 28G. הכן שלב רציף בלתי מסיס המורכב מ- 5% (w/ w) פלואורוסורפקטנט ו- 1% N,N, NN-טטרמתילטילנדיאמין (TEMED) בשמן הידרופלואורואטר (HFE) לייצור וייצוב של טיפות. טען את הפתרון למזרק חדש של 1 מ”ל. טען הן את פתרון PAA והן את פתרון HFE המכיל מזרקים למשאבות מזרק (למשל, NE-501). חבר את שני המזרקים למכשיר המיקרופלואידי באמצעות צינורות פוליאתילן המוחדרים למזרק ולתוך המכשיר. לפני החיבור, יש להקנות את המשאבות כדי להסיר את האוויר מהצינורות.הערה: בהתאם לדגם, משאבות מזרק עשויות להיות נשלטות באמצעות תוכנת קלט, ייצור מובנית או סקריפט מותאם אישית (זמין ב- https://github.com/AbateLab/Pump-Control-Program). הפעל את התקן יצירת ההנפה עם כניסות שמן PAA ו- HFE במהירות של 300 μL/ שעה ו- 500 μL / שעה, בהתאמה. לאסוף 1 מ”ל של טיפות בצינור איסוף 15 מ”ל ודגרה במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר עבור פילמור. לאחר הדגירה, להסיר את השכבה התחתונה של שמן על ידי pipetting. הוסף 1 מ”ל של 20% (v/v) perfluoro-1-octanol (PFO) בשמן HFE לצינור איסוף 15 מ”ל כמו demulsifier כימי. לאחר ערבוב, לסובב את צינור אוסף 15 מ”ל ב 2000 x g במשך 2 דקות. הסר את ה- PFO / HFE supernatant על ידי צנרת. חזור על 1x. הוסיפו 2 מ”ל של 2% סורביטן מונולאט בהקסאן לצינור האוסף והמערבולת של 15 מ”ל לערבוב. לסובב את הצינור ב 3000 x g במשך 3 דקות. הסר את supernatant על ידי pipetting כדי להסיר פתרון פעילי שטח / hexane. חזור על 2x. הוסף 5 מ”ל של חוצץ TEBST (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 274 מ”מ NaCl, 5.4 מ”מ KCl, 20 mM EDTA, 0.2% טריטון X-100) ומערבב היטב. ספין למטה ב 3,000 x g במשך 3 דקות. הסר את supernatant על ידי pipetting. חזור על 3x. Resuspend ב 5 מ”ל TEBST. פתרון זה עשוי להיות מאוחסן ב 4 °C ללא הגבלת זמן. 2. תחליב תבנית חלקיקים. לאחר הכנת חלקיקים templating, PTE משמש כדי לתמצת את המדגם ריאגנטים בטיפות. הכן את חלקיקי polyacrylamide עבור תחליב תבנית חלקיקים על ידי centrifuging ב 6000 x גרם במשך 1 דקות כדי לגלות את החלקיקים, ולאחר מכן להסיר את supernatant על ידי pipetting ו resuspend באמצעות מים סטריליים. חזור על 3x כדי להבטיח הסרה של כל שאריות TEBST. לקבוע את הריכוז ואת הקוטר של חלקיקים templating באמצעות hemocytometer (או שווה ערך). חשב קוטר חלקיקים בודד על ידי מדידת הקטרים בפיקסלים והמרה למיקרונים. ניתן לחשב את המרת הפיקסלים למיקרונים באמצעות המוציטומטר (או שווה ערך) כשקופית כיול ומדידת מרחק הרשת הידוע בפיקסלים. הכן את שלב הפיזור בצינור מיקרוצנטריפוגה טרי 1.5 מ”ל באמצעות תערובת מאסטר PCR, פריימרים מתאימים, ובדיקת הידרוליזה פלואורסצ’ין על פי טבלה 1. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות תחת עצבנות עדינה (10 סל”ד) באמצעות סיבוב צינור כדי להבטיח חלוקה הומוגנית של הרכיבים.הערה: נפח וריכוז היעד של חלקיקים מבוססים על טעינת פואסון. ככלל, מספר החלקיקים צריך להיות סדר גודל גדול יותר ממספר הדגימות שיש לתמצת. עבור דגימות של ריכוזים לא ידועים, סדרת דילול יש צורך להבטיח טעינת פואסון. נפח מגיב 100 μL חלקיקים (450 חלקיקים / μL) 200 μL תערובת אב 2X PCR 18 μL פריימר קדמי של 10 מיקרומטר 18 μL פריימר הפוך 10 מיקרומטר 18 μL 10 μM בדיקה 0.8 μL טריטון X100 45.2 μL מים ללא נוקלאז טבלה 1. הכנת תערובת אמן PCR המשמשת עם PTE עבור PCR טיפה דיגיטלית. צנטריפוגה שלב הפיזור ב 6000 x g במשך 1 דקות ולהסיר את supernatant. הקלט את עוצמת הקול של supernatant שחולץ ושימוש בנפח פאזה הפיזור הכולל המחושב ב 2.3 לקבוע את נפח הכדור.הערה: כמות supernatant שחולצו ישתנה בהתאם אריזת חלקיקים, קוטר, וריכוז עם נפח צפוי מינימלי של 300 μL. הוסף 1 μL של 1.62 pg / μL Saccharomyces cerevisiae DNA גנומי לכדור מ 2.4 ולערבב ביסודיות על ידי pipetting או הקשה נמרצת.הערה: נוכחות של תוכן מימי עודף יכול להפחית את יעילות אנקפסולציה. אם נפח המדגם עולה על 1% מנפח הכדור, לרכז את המדגם. אם לא ניתן לרכז את המדגם, שנה את קנה המידה של תערובת ה- PCR הראשית וכתוצאה מכך את עוצמת הכדור בהתאם לאמצעי האחסון לדוגמה. PTE מאפשר אמולסיה של חלקיקים קטנים (10 μL) לנפחים גדולים (2 מ”ל) של חלקיקים טמפלטינג. תערובת המאסטר PCR (2.3) ושמן (2.6) ניתן לשנות את קנה המידה על פי היעד (2.3) ונמדד (2.4) נפח של כדורי החלקיקים בהתאמה. הוסף 200 μL 2% פלואורוסורפקטנט בשמן HFE לצינור כשלב רציף בלתי מסיס לתבלינים. ודא שהכדור מתנתק על ידי צנרת או הקשה/הבהוב של הצינור. ואז מערבולת ב 3000 סל”ד במשך 30 שניות.הערה: ההגדרה המתאימה ל- 3000 סל”ד עשויה להשתנות בהתאם למותג ולדגם. אפשר אמולסיות להסתפק 1 דקות. הסר 100 μL של שלב השמן התחתון ולהחליף נפח זה עם 2% פלואורוסורפקטנט טרי בשמן HFE. הפוך בעדינות את הצינור מספר פעמים לערבב. חזור על 3-5x או עד טיפות לווין קטנות הוסרו. 3. טיפה דיגיטלית PCR וניתוח. לאחר 2-5 דקות של התיישבות, להסיר את שלב השמן התחתון. החלף נפח זה עם 5% פלואורוסורפקטנט בשמן פלואורוקרבון (למשל, FC-40). באמצעות קצה פיפטה רחב, בזהירות pipette 100 μL של מדגם לתוך 200 צינורות PCR μL. מניחים את צינורות ה- PCR לתוך תרמוציקלר ולהפעיל על פי טבלה 2. צעד טמפרטורה משך הערות 1 95 °C (75 °F) 2 דקות 2 95 °C (75 °F) שנות ה-30 3 50 °C (50 °F) שנות ה-90 4 72 °C (72 °F) שנות ה-60 5 חזור על x34 שלבים 2 עד 4 6 72 °C (72 °F) 2 דקות 7 4 °C (70 °F) אחז טבלה 2. תנאי תרמו-אופניים עבור PCR טיפה דיגיטלית באמצעות אמולסיות PTE. Pipette המדגם על שקופית ספירה באמצעות קצה פיפטה משעמם רחב להדמיה פלואורסצנטית. צלם את המדגם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם עירור של 490 ננומטר ואורכי גל לזיהוי פליטה של 525 ננומטר. לכמת את טיפות הפלואורסצנט החיוביות (Np) ואת הטיפות הכוללות (NT) כדי לאמת את הנוכחות ולחשב את מספר מולקולות התבנית (λ) באמצעות שבר הטיפות החיוביות (Np/ NT) וסטטיסטיקת פואסון: חשב את מרווח הביטחון של 95% (zc = 1.96) לפי: חשב את ריכוז המדגם (מולקולות/μL) באמצעות הנפח (ν ב- μL) של המדגם שנוסף בשלב 2.5, באמצעות המשוואה שניתנה להלן. קבע את הממוצע ואת סטיית התקן של ריכוז המדגם באמצעות שכפולים טכניים.