粒子テンプレート化乳化により、マイクロ流体フリーのドロップレットアッセイが可能

1. 粒子テンプレート化乳化のためのヒドロゲル粒子の調製。 粒子テンプレート化乳化に用いるヒドロゲル粒子は、2つの異なる方法を用いて調製することができる。 市販の粒子を用いた調製 PTEと互換性のある乾燥ポリアクリルアミド粒子(例えば、バイオゲルP-60ゲル(バイオ・ラッド)、直径45~90μm)を50mL円錐チューブに30mLの無菌水に加え、よく混ぜます。室温で30分間インキュベートします。 微粒子のマイクロ流体製造を用いた調製注:PTEと互換性のあるポリアクリルアミド粒子は、市販のドロップメーカー(例えば、QX200ドロップ発生器(バイオ・ラッド)、レイドロップ(フルージェント)など)、またはカスタムマイクロ流体設計を使用して調製することができます。カスタムマスターの製作 コンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェアを使用して、柔らかいフォトリソグラフィマスクを設計します。基板フィルムに10μmの解像度でフォトマスクを印刷します。 シリコンウエハーの3の中心にフォトレジストの1 mLを注ぎます。スピンコーターを使用して、500 rpmで30秒間回転させ、その後30秒間1250 rpmで回転させることで、フォトレジストの50 μm層を作成します。ウエハーをホットプレートに置き、95°Cに設定して15分間置き、溶剤を蒸発させます。 カバーガラススライドでシリコンウエハにフォトマスクを固定し、コリメートされた190 mW、365 μm UV LEDの下でウエハーを2.5分間露出させます。ウエハーをホットプレートに置き、95°Cに設定して5分間、露光後焼成します。 フォトレジストシリコンウエハーを100%プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート(PGMEA)の浴中に15分間浸漬して開発します。新鮮な100%PGMEAでウエハーをリンスし、その後100%イソプロパノールを続けてください。空気はウエハーを乾燥させる。 95°Cに設定したホットプレートでウエハを1分間乾燥させて、残留イソプロパノールを取り除きます。ペトリ皿の清潔な3にウエハースを置きます。 カスタムマイクロ流体デバイスの製造 ポリジメチルシロキサン(PDMS)シリコンベースと硬化試薬を10:1の割合で質量で混合します。空気泡が観察されなくなるまで、ハウス真空下でデシケータを使用して混合PDMSを脱気する。 シャーレのマスターの上に脱気PDMSを注ぎ、シリコンウエハーが完全に水没していることを確認します。シリコンウエハとPDMSを脱気し、注ぎ込み中に形成された気泡を除去する。 シリコンウエハとPDMSを65°Cにセットしたオーブンに60分以上入れることで、PDMSを硬化します。メスを使用してシャーレからマイクロ流体特徴を含むPDMSのブロックを物品化する。シリコンマスターに存在する機能を損なわないように、細心の注意を払ってください。 0.75 mm のバイオプシー パンチを使用して、マイクロ流体デバイスの入口と出口に対応する PDMS ブロックに入口と出口をパンチします。PDMSブロックの表面への包装テープの除去を繰り返し塗布し、除去して、ほこりや微粒子を除去します。 50mm x 75 mmガラススライドを100%イソプロパノールで洗浄し、その後空気で表面を乾燥させます。プラズマは、プラズマボンダを使用して1分間のO2 プラズマの1 mbarを使用して、ガラススライドとPDMS(上向きの特徴)の両方を処理します。 ガラススライド上に下向きの特徴を備えたプラズマ処理されたPDMSを置くことによって、PDMSをガラススライドに貼り付け、プラズマ処理された側面を上に向けて処理する。スライドを65°Cに設定したオーブンに30分以上入れ、ボンディングを完了します。 フッ素化表面処理でマイクロ流体チャネルをすべて処理し、表面の疎水性を確保し、濡れ防止を行います。65°Cで10分以上焼きます。 テンプレート粒子の製作 6.2%のアクリルアミド、0.18%N、N’-メチレンビス(アクリルアミド)、および0.3%の過硫酸アンモニウムからなるポリアクリルアミド(PAA)溶液を調製します。この溶液を28G針で1mLの注射器に入れる。 5%(w/w)フルオロサーファクタントと1%N、N、NN-テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)からなる不溶性連続相をハイドロフルオロエーテル(HFE)油中に調製し、液滴の生成と安定化を行います。新しい1 mLシリンジに溶液をロードします。 注射器を含むPAAとHFE溶液の両方をシリンジポンプにロードします(例えば、NE-501)。両方のシリンジをマイクロ流体デバイスに接続するには、シリンジに挿入されたポリエチレンチューブを使用してデバイスに接続します。接続する前に、ポンプをプライムしてチューブから空気を取り除く。注:モデルによっては、インプット、製造ソフトウェア、またはカスタムスクリプト(https://github.com/AbateLab/Pump-Control-Program で利用可能)でシリンジポンプを制御することができます。 PAAおよびHFEオイル入力をそれぞれ300 μL/hおよび500 μL/hでドロップ生成装置を実行します。15 mLの回収チューブに液滴1mLを回収し、重合のために室温で3時間インキュベートします。インキュベーション後、ピペット処理により下層の油を除去する。 HFEオイルに20%(v/v)パーフルオロ-1オクタノール(PFO)の1 mLを化学デマルシファーとして15 mL回収管に加えます。混合後、2000 x g で 15 mL のコレクションチューブを 2 分間回転させます。ピペット処理でPFO/HFE上清を取り外します。1x を繰り返します。 2%ソルビタンモノオレネートの2 mLをヘキサンに加えて、15 mLのコレクションチューブと渦を混ぜます。3000 x g でチューブを 3 分間回転させます。界面活性剤/ヘキサン溶液を除去するためにピペット処理することにより上清を除去します。2x を繰り返します。 TEBSTバッファー(20 mMトリス-HCl pH 8.0、274 mM NaCl、5.4 mM KCl、20 mM EDTA、0.2%トリトンX-100)を5 mL加え、よく混ぜます。3,000 x g で 3 分間スピンダウンします。上清をピペットで取り除く。3x を繰り返します。 5 mL TEBST で再中断します。この溶液は、4°Cで無期限に保存することができる。 2.粒子テンプレート乳化。 粒子のテンプレート化の調製に続いて、PTEは、液滴中のサンプルおよび試薬をカプセル化するために使用される。 粒子をペレットに6000 x g で遠心して粒子を鋳造した乳化用のポリアクリルアミド粒子を調製し、その後、ピペット処理により上清を除去し、滅菌水を使用して再懸濁液を行う。残りの TEBST を確実に除去するために 3x を繰り返します。 ヘモサイトメーター(または同等)を使用して、テンプレート粒子の濃度と直径を決定します。直径をピクセル単位で測定し、ミクロンに変換することで、個々の粒子径を計算します。ピクセルからミクロンへの変換は、測光スライドとしてヘモサイトメーター(または同等)を用いて計算し、既知のグリッド距離をピクセル単位で測定することができる。 PCRマスターミックスを用いて1.5mLマイクロ遠心分離管に分散相を調製し、適当なプライマー、およびフルオレセイン加水分解プローブを 表1に記載する。穏やかな攪拌(10 rpm)下で室温で5分間インキュベートし、チューブ回転器を使用して、成分の均質な分布を確保します。注: パーティクルの体積とターゲットの濃度は、ポアソンの負荷に基づいています。一般的に、パーティクルの数は、カプセル化するサンプルの数よりも桁違いにする必要があります。未知の濃度のサンプルの場合、ポアソンの負荷を確実にするために希釈シリーズが必要です。 容積 試薬 100 μL 粒子(450粒子/μL) 200 μL 2x PCR マスターミックス 18 μL 10 μMフォワードプライマー 18 μL 10 μM リバースプライマー 18 μL 10 μM プローブ 0.8 μL トリトンX100 45.2 μL ヌクレアーゼフリーウォーター 表 1.PTEと共に使用するPCRマスターミックスの調製 6000 x g で分散相を 1 分間遠心し、上清を除去します。抽出した上清の体積を記録し、 2.3 で計算した分散相総体積を用いてペレット体積を決定する。注:抽出される上清の量は、粒子のパッキング、直径、および最小予想体積300 μLの濃度によって異なります。 1.62 pg /μL サッカロミセスセレビシエ ゲノムDNAを2.4からペレットに1 μL加え、ピペットまたは活発なタッピングで十分に混合します。注: 過剰な水性コンテンツが存在すると、カプセル化の効率が低下する可能性があります。サンプル量がペレット体積の1%を超える場合は、サンプルを濃縮します。サンプルを濃縮できない場合は、サンプル量に応じて PCR マスターミックスと結果ペレットの量をスケールします。PTEは、小さな(10 μL)から大きい(2 mL)の粒子の乳化を可能にします。PCRマスターミックス(2.3)とオイル(2.6)は、それぞれ粒子ペレットの目標(2.3)および測定(2.4)体積に応じてスケーリングすることができる。 200 μL 2% HFE油中のフルオロサーファクタントを、乳化のための不溶な連続相としてチューブに加えます。ピペットまたはチューブをタップ/フリックしてペレットが外れていることを確認します。その後、3000rpmで30秒間渦を起用する。注:3000 rpm に対応する設定は、ブランドやモデルによって異なります。 エマルジョンが1分間落ち着くようにします。底部油相の100 μLを取り除き、HFEオイルのフレッシュ2%フルオロサーファクタントに交換してください。チューブを数回軽く反転して混ぜます。3~5倍、または小さな衛星液滴が取り除かれるまで繰り返します。 3. デジタル液滴 PCR および分析。 沈降の2〜5分後、底部の油相を取り除きます。この容量をフルオロカーボン油中の5%のフルオロサーファクタント(例えばFC-40)に交換してください。 広いボアピペットチップを使用して、100 μLのサンプルを200 μLのPCRチューブに慎重にピペットします。PCRチューブをサーモサイクラーに入れ、 表2に従って実行します。 歩 温度 期間 筆記 1 95°C 2分 2 95°C 30 s 3 50°C 90 s 4 72°C 60 s 5 x34 の手順 2 ~ 4 を繰り返します。 6 72°C 2分 7 4°C 持つ 表 2.PTEエマルジョンを用いたデジタル液滴PCRの熱サイクル条件 蛍光イメージング用の広いボアピペットチップを使用して、サンプルを計数スライドにピペットします。490 nm励起および525 nmの発光検出波長を有する蛍光顕微鏡を使用してサンプルを画像化する。 正の蛍光滴(Np)と総滴(NT)を定量化して存在を確認し、正の液滴(Np/NT)とポアソン統計量の割合を使用してテンプレート分子(λ)の数を計算します。 95% 信頼区間 (zc = 1.96) を計算するには、次の手順を実行します。 以下に示す式を使用して、ステップ 2.5で添加したサンプルの体積(μLでν)を用いて、サンプル濃度(分子/μL)を計算します。技術的な反復を使用して、サンプル濃度の平均と標準偏差を決定します。