Deeltjessjabloonemulgering maakt microfluïdische druppeltests mogelijk

1. Voorbereiding van hydrogeldeeltjes voor emulgering van deeltjes. Hydrogeldeeltjes die worden gebruikt voor emulgering van deeltjessjablonen kunnen met twee verschillende methoden worden bereid. Bereiding met behulp van in de handel verkrijgbare deeltjes Voeg 0,5 g gedroogde polyacrylamidedeeltjes die compatibel zijn met PTE (bijv. Bio-Gel P-60 Gel (Bio-Rad), 45-90 μm diameter) toe aan 30 ml steriel water in een conische buis van 50 ml en meng goed. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Bereiding met behulp van microfluïdische fabricage van deeltjesOPMERKING: Polyacrylamidedeeltjes die compatibel zijn met PTE kunnen worden bereid met behulp van in de handel verkrijgbare druppelmakers (bijv. QX200 Drop Generator (Bio-Rad), RayDrop (Fluigent) enz.), Of door een aangepast microfluïdisch ontwerp.Fabricage van aangepaste master Ontwerp een zacht fotolithografiemasker met behulp van CAD-software (Computer-Aided Design). Print het fotomasker met een resolutie van 10 μm op printplaatfolie. Giet 1 ml fotoresist op het midden van een 3 in silicium wafer. Gebruik een spincoater om een fotoresistlaag van 50 μm te creëren door deze gedurende 30 seconden bij 500 tpm te draaien, gevolgd door 1250 tpm gedurende 30 seconden. Plaats de wafer gedurende 15 minuten op een kookplaat die is ingesteld op 95 °C om het oplosmiddel te verdampen. Bevestig het fotomasker op de siliciumwafer met een afdekglasplaat en stel de wafer gedurende 2,5 minuten bloot onder een gecollimeerde 190 mW, 365 μm UV-LED. Plaats de wafer op een kookplaat die gedurende 5 minuten op 95 °C is ingesteld voor het bakken na blootstelling. Ontwikkel de fotoresist-siliciumwafer door deze onder te dompelen in een bad van 100% propyleenglycolmonomethyletheracetaat (PGMEA) gedurende maximaal 15 minuten. Spoel de wafer af met verse 100% PGMEA gevolgd door 100% isopropanol. Droog de wafer aan de lucht. Verwijder eventuele resterende isopropanol door de wafer gedurende 1 minuut te drogen op een kookplaat die is ingesteld op 95 °C. Doe de wafel in een schone 3 in petrischaal. Fabricage van het aangepaste microfluïdische apparaat Meng de siliciumbasis polydimethylsiloxaan (PDMS) en het uithardingsreagens in een massaverhouding van 10:1. Ontgas het gemengde PDMS met behulp van een exsiccator onder huisvacuüm totdat er geen luchtbellen waarneembaar zijn. Giet het ontgaste PDMS over de master in de petrischaal, zodat de siliciumwafer volledig onder water komt te staan. Ontgas de siliciumwafer en PDMS om eventuele luchtbellen te verwijderen die zich tijdens het gieten hebben gevormd. Hard de PDMS uit door de siliciumwafer en PDMS gedurende ten minste 60 minuten in een oven op 65 °C te plaatsen. Verwijder een blok PDMS met de microfluïdische kenmerken uit de petrischaal met behulp van een scalpel. Wees extra voorzichtig om te voorkomen dat eventuele functies op de siliciummaster worden beschadigd. Pons de inlaten en de uitlaten in het PDMS-blok dat overeenkomt met de in- en uitlaten in het microfluïdische apparaat met behulp van een biopsiepons van 0,75 mm. Verwijder stof en deeltjes met het herhaaldelijk aanbrengen en verwijderen van verpakkingstape op het oppervlak van het PDMS-blok. Reinig een glasplaat van 50 mm x 75 mm door deze af te spoelen met 100% isopropanol en vervolgens het oppervlak aan de lucht te drogen. Plasma behandelt zowel de glasplaat als de PDMS (functies naar boven gericht) met behulp van 1 mbar O2-plasma gedurende 1 minuut met behulp van een plasma-bonder. Bevestig de PDMS op de glasplaat door de met plasma behandelde PDMS met functies naar beneden op de glasplaat te plaatsen, plasmabehandelde zijde naar boven. Plaats de schuif in een oven die ten minste 30 minuten op 65 °C is ingesteld om de hechting te voltooien. Behandel alle microfluïdische kanalen met een gefluoreerde oppervlaktebehandeling om oppervlaktehydrofobiciteit te garanderen en bevochtiging te voorkomen. Bak het apparaat minstens 10 minuten op 65 °C. Fabricage van templaatdeeltjes Bereid een polyacrylamide (PAA) oplossing bestaande uit 6,2% acrylamide, 0,18% N, N′-methyleenbis (acrylamide) en 0,3% ammoniumperssulfaat. Laad deze oplossing in een spuit van 1 ml met een naald van 28 G. Bereid een onoplosbare continue fase bestaande uit 5% (m/w) fluorosurfactant en 1% N,N,NN-tetramethylethyleendiamine (TEMED) in fluorkoolwaterstofolie (HFE) voor de vorming en stabilisatie van druppels. Laad de oplossing in een nieuwe spuit van 1 ml. Laad zowel PAA- als HFE-oplossing met spuiten in spuitpompen (bijv. NE-501). Sluit beide spuiten aan op het microfluïdische apparaat met behulp van polyethyleenslangen die op de spuit en in het apparaat zijn ingebracht. Voordat u aansluit, bereidt u de pompen voor om de lucht uit de slang te verwijderen.OPMERKING: Afhankelijk van het model kunnen spuitpompen worden aangestuurd met ingebouwde invoer, fabricagesoftware of een aangepast script (verkrijgbaar bij https://github.com/AbateLab/Pump-Control-Program). Laat het dropgeneratie-apparaat met PAA- en HFE-olie-ingangen draaien op respectievelijk 300 μL/h en 500 μL/h. Verzamel 1 ml van de druppels in een opvangbuis van 15 ml en incubeer gedurende 3 uur bij kamertemperatuur voor polymerisatie. Verwijder na de incubatie de onderste laag olie door te pipetteren. Voeg 1 ml 20% (v/v) perfluor-1-octanol (PFO) in HFE-olie toe aan de opvangbuis van 15 ml als chemische demulgator. Draai na het mengen de opvangbuis van 15 ml gedurende 2 minuten op 2000 x g . Verwijder het PFO/HFE-supernatant door te pipetteren. Herhaal dit 1x. Voeg 2 ml 2% sorbitanmonooleaat in hexaan toe aan de verzamelbuis van 15 ml en vortex om te mengen. Draai de buis gedurende 3 min op 3000 x g . Verwijder het supernatant door te pipetteren om oppervlakteactieve stof/hexaanoplossing te verwijderen. Herhaal dit 2x. Voeg 5 ml TEBST-buffer toe (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 274 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 20 mM EDTA, 0,2% Triton X-100) en meng goed. Draai gedurende 3 minuten naar beneden bij 3.000 x g . Verwijder het supernatant door te pipetteren. Herhaal dit 3x. Resuspend in 5 mL TEBST. Deze oplossing mag voor onbepaalde tijd bij 4 °C worden bewaard. 2. Emulgering van deeltjessjablonen. Na de bereiding van templaatdeeltjes wordt PTE gebruikt om het monster en de reagentia in druppels in te kapselen. Bereid de polyacrylamidedeeltjes voor op emulgering van deeltjes door gedurende 1 minuut te centrifugeren bij 6000 x g om de deeltjes te pelleteren, verwijder vervolgens het supernatant door te pipetteren en opnieuw te suspenderen met steriel water. Herhaal dit 3x om ervoor te zorgen dat eventuele resterende TEBST wordt verwijderd. Bepaal de concentratie en diameter van de templating deeltjes met behulp van een hemocytometer (of gelijkwaardig). Bereken de individuele deeltjesdiameter door de diameters in pixels te meten en om te zetten in microns. Conversie van pixels naar microns kan worden berekend met behulp van de hemocytometer (of gelijkwaardig) als een kalibratieschuif en het meten van de bekende rasterafstand in pixels. Bereid de dispersiefase voor in een verse microcentrifugebuis van 1,5 ml met behulp van een PCR-mastermix, de juiste primers en een fluoresceïnehydrolysesonde volgens tabel 1. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten onder zacht roeren (10 rpm) met behulp van een buisrotator om een homogene verdeling van de componenten te garanderen.OPMERKING: Het volume en de doelconcentratie van deeltjes zijn gebaseerd op poissonbelasting. Als algemene regel geldt dat het aantal deeltjes een orde van grootte groter moet zijn dan het aantal monsters dat moet worden ingekapseld. Voor monsters met onbekende concentraties is een verdunningsreeks nodig om de Poisson-belasting te waarborgen. Volume Reagens 100 μL Deeltjes (450 deeltjes / μL) 200 μL 2x PCR master mix 18 μL 10 μM voorwaartse primer 18 μL 10 μM omgekeerde primer 18 μL 10 μM sonde 0,8 μL Triton X100 45,2 μL Nuclease vrij water Tabel 1. Bereiding van de PCR-mastermix gebruikt met PTE voor digitale druppel PCR. Centrifugeer de dispergeerfase bij 6000 x g gedurende 1 min en verwijder het supernatant. Noteer het volume van het geëxtraheerde supernatant en bepaal met behulp van het totale disperse fasevolume berekend in 2.3 het pelletvolume.OPMERKING: De hoeveelheid geëxtraheerd supernatant varieert afhankelijk van de deeltjesverpakking, diameter en concentratie met een minimaal verwacht volume van 300 μL. Voeg 1 μL van 1,62 pg /μL Saccharomyces cerevisiae genomisch DNA toe aan de pellet van 2,4 en meng grondig door pipetteren of krachtig tappen.OPMERKING: De aanwezigheid van overtollig waterig gehalte kan de inkapselingsefficiëntie verminderen. Als het monstervolume meer dan 1% van het pelletvolume bedraagt, concentreert u het monster. Als het monster niet kan worden geconcentreerd, schaalt u het PCR-hoofdmengsel en het resulterende pelletvolume op basis van het monstervolume. PTE maakt de emulgering van kleine (10 μL) tot grote (2 ml) volumes templaatdeeltjes mogelijk. De PCR-mastermix (2.3) en olie (2.6) kunnen worden geschaald volgens respectievelijk het doelvolume (2.3) en het gemeten (2.4) volume van de deeltjeskorrel. Voeg 200 μL 2% fluorosurfactant in HFE-olie toe aan de buis als de onoplosbare continue fase voor emulgering. Zorg ervoor dat de pellet wordt losgemaakt door de buis te pipetteren of te tikken/vegen. Dan vortex bij 3000 rpm gedurende 30 sec.OPMERKING: De instelling die overeenkomt met 3000 tpm kan variëren, afhankelijk van het merk en het model. Laat de emulsies 1 min bezinken. Verwijder 100 μL van de onderste oliefase en vervang dit volume door verse 2% fluorosurfactant in HFE-olie. Keer de buis voorzichtig meerdere keren om om te mengen. Herhaal dit 3-5x of totdat kleine satellietdruppeltjes zijn verwijderd. 3. Digitale druppel PCR en analyse. Verwijder na 2-5 minuten bezinken de onderste oliefase. Vervang dit volume door 5% fluorosurfactant in fluorkoolstofolie (bijv. FC-40). Pipetteer met behulp van een pipetpunt met brede boring voorzichtig de 100 μL monster in PCR-buizen van 200 μL. Plaats de PCR-buizen in een thermocycler en voer uit volgens tabel 2. Stap Temperatuur Duur Notities 1 95 °C 2 min. 2 95 °C 30 s 3 50 °C 90 s 4 72 °C 60 s 5 Herhaal x34 stap 2 tot en met 4 6 72 °C 2 min. 7 4 °C houden Tabel 2. Thermocyclische omstandigheden voor digitale druppel PCR met behulp van PTE emulsies. Pipetteer het monster op een telschuif met behulp van een pipetpunt met brede boring voor fluorescerende beeldvorming. Stel het monster voor met een fluorescerende microscoop met 490 nm excitatie en 525 nm emissiedetectiegolflengten. Kwantificeer de positieve fluorescerende druppels (Np) en totale druppels (NT) om de aanwezigheid te verifiëren en het aantal sjabloonmoleculen (λ) te berekenen met behulp van de fractie van positieve druppels (Np / NT) en Poisson-statistieken: Bereken het 95% betrouwbaarheidsinterval (zc = 1,96) met: Bereken de monsterconcentratie (moleculen/μL) met behulp van het volume (ν in μL) van het monster dat in stap 2.5 is toegevoegd, met behulp van de onderstaande vergelijking. Bepaal het gemiddelde en de standaardafwijking van de monsterconcentratie met behulp van technische replicaties.