مستحلب الجسيمات قالب تمكن المقايسات قطرة Microfluidic خالية
Summary
تعتبر مقايسات قطرات الماء في الزيت مفيدة للكيمياء التحليلية وتطور الإنزيم وتحليل الخلايا المفردة ، ولكنها تتطلب عادة مركبات ميكروفلويديك لتشكيل القطرات. هنا، ونحن نصف مستحلب الجسيمات قالب، وهو نهج خالية من microfluidic لأداء المقايسات قطرة.
Abstract
ردود الفعل التي أجريت في قطرات أحادية التشتت تحمل دقة وحساسية معززة مقارنة مع تلك التي أجريت بكميات كبيرة. ومع ذلك ، فإن شرط microfluidics لتشكيل قطرات تسيطر عليها يفرض حاجزا على غير الخبراء ، والحد من استخدامها. هنا ، نصف مستحلب الجسيمات المنماذج ، وهو نهج لتوليد قطرات أحادية التشتت دون microfluidics. باستخدام المجالات الهيدروجيل templating، ونحن تغليف العينات في قطرات أحادية التشتت عن طريق دوامة بسيطة. نحن نثبت هذا النهج باستخدامه لأداء PCR الرقمية الخالية من السوائل الدقيقة.
Introduction
تستفيد Droplet microfluidics من التقسيم في قطرات البيكوليتر لزيادة حساسية ودقة المقايسات مقارنة بالتفاعلات السائبة ، ولها العديد من التطبيقات في الفحص الكيميائي وهندسة البروتين وتسلسل الجيل التالي1،2،3. على سبيل المثال، يتيح تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي (ddPCR) دقة متزايدة مقارنة بسلسلة تفاعل البوليميراز الكمية السائبة (qPCR)، مع تطبيقات للاختلاف الوراثي في السرطانات، والكشف عن الأمراض المسببة للطفرات، وتشخيص ما قبل الولادة4،5،6. ومع ذلك، فإن التحدي المتمثل في المركبات الدقيقة القطرات هو اشتراط وجود أجهزة ميكروفلويديك لتقسيم العينات؛ في حين أن microfluidics تحمل سيطرة ممتازة على خصائص القطيرات ، فإنها تتطلب خبرة متخصصة لبناء وتشغيل7،8. وبالتالي، تقتصر الأساليب القائمة على القطيرات إلى حد كبير على مختبرات الخبراء أو، في حالات نادرة، التطبيقات التي تتوفر فيها أداة تجارية 9,10. لتوسيع استخدام المقايسات قطرة، شرط لأجهزة microfluidic المتخصصة هي عقبة يجب التغلب عليها.
في هذه المقالة، نقوم بوصف مستحلب الجسيمات (PTE)، وهي طريقة خالية من السوائل الدقيقة لأداء ردود الفعل في قطرات أحادية التشتت. في PTE، تبتلع جزيئات التمبلر العينة إلى قطرات في زيت الناقل عن طريق الدوامة البسيطة (الشكل 1). ومع اختلاط النظام، يتفتت الجزء المائي إلى قطرات من الحجم المتناقص حتى تحتوي القطرات على جزيئات مفردة، وعند هذه النقطة لا يمكن زيادة التجزؤ لأنه يتطلب كسر الجسيمات. تحيط العينة الغارقة بالجسيمات كقشرة في القطرات ، وبالتالي تغليف أي خلايا مشتتة أو كاشفات أو مويتات وظيفية (الشكل 1D). وبالتالي ، لا يتطلب PTE أي معدات أو خبرة لأداء ردود فعل قطرات تتجاوز الدوامة الشائعة. بالإضافة إلى ذلك ، يستغرق توليد القطيرات ثوان مقارنة بالدقائق أو الساعات مع microfluidics ، والكمية المنتجة تتناسب مع حجم الحاوية ، وليس وقت تشغيل الجهاز ، مما يجعلها قابلة للتطوير بشكل كبير. هذه الفوائد تجعل PTE مثالية لإجراء المقايسات قطرة في مجموعة متنوعة من الظروف التي microfluidics غير عملي. هنا، ونحن نثبت PTE واستخدامه لإجراء ddPCR.
الشكل 1 – الأرقام 1– الأرقام 1 نظرة عامة على عملية استحلاب الجسيمات المنماذجة. (أ) تختلط جزيئات التمبلات بالكواشف. (ب) إزالة الكواشف الزائدة بعد الطرد المركزي. (ج) إضافة جزيئات قالب يحدث قبل إضافة النفط. (د) تنتج الدوامة قطرات تحتوي على جزيء قالب واحد. (ه) يسمح التصوير والسيكلات الحرارية اللاحقة بتحليل رقمي للنماذج المستهدفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
يستخدم PTE الجسيمات لتغليف العينات في قطرات أحادية التشتت عن طريق الدوامة. بالإضافة إلى بساطتها وسهولة الوصول إليها ، توفر PTE العديد من الفوائد الإضافية ، بما في ذلك السماح بتوليد كميات كبيرة من القطرات على الفور. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء العملية في أنبوب معزول، مما يلغي الحاجة إلى نقل العينات إلى أجهزة ميكروفلويديك، وتبسيط سير العمل العام والحد من فرص تلوث العينات أو فقدانها. كما توفر جزيئات التمبلات وسيلة لهندسة محتويات تفاعلات القطرات الناتجة. على سبيل المثال، يمكن هندسة حجم الجسيمات والكيمياء والقدرة على الاشتعال للجزيئ الحيوي المستهدف أو التقاط الخلايا، في حين يمكن عرض ال moieties الوظيفية مثل الإنزيمات أو النشاطات أو الأحماض النووية على الجسيمات لتسهيل ردود الفعل، مثل تسلسل الخلية الواحدة أو التوصيف الوظيفي. ومع أن النهج مرن، فإن هناك مع ذلك قيودا هامة على استخدامه. فعلى سبيل المثال، لا يمكن حاليا إجراء إضافات قطرات كما تجرى في كثير من الأحيان باستخدام المركبات الدقيقة، مما يتطلب إدخال جميع مكونات التفاعل قبل التغليف؛ وهذا يتطلب أن تكون الكواشف متوافقة ومستقرة حتى يمكن توليد قطرات، وفي حالة تركيبات مزعجة، يمكن في كثير من الأحيان معالجتها عن طريق خلط بسرعة ومستحلب العينة على الجليد. بدلا من ذلك، يمكن استخدام المكونات التفاعلية التي يمكن تشغيلها خارجيا مع الضوء أو الحرارة13. وبالتالي توفر PTE طريقة مرنة وقابلة للتوسع لإجراء عمليات فحص القطيرات التي يمكن لغير الخبراء الوصول إليها. هذا، إلى جانب بساطته الفطرية والمرونة، يجعل PTE مثالية لتنفيذ وتطوير العديد من التطبيقات القطيرات.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل في وضع هذا البروتوكول المعاهد الوطنية للصحة (R01-EB019453-02)، ومكتب مدير الاستخبارات الوطنية، نشاط مشاريع البحوث المتقدمة الاستخبارات من خلال شركة رايثيون BBN تكنولوجيز كورب (N66001-18-C-4507)، وبرنامج تشان زوكربيرج Biohub المحقق، وكالة مشاريع البحوث المتقدمة الدفاع من خلال جامعة تكساس A & M (W911NF1920013)، ومراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها من خلال جامعة جونز هوبكنز تطبيقها مختبر الفيزياء (75D30-11-9C-06818 (CDC3)). إن الآراء والاستنتاجات الواردة هنا هي آراء المؤلفين ولا ينبغي تفسيرها على أنها تمثل بالضرورة السياسات الرسمية، سواء كانت صريحة أو ضمنية، للمنظمات المذكورة أعلاه أو حكومة الولايات المتحدة. حكومة الولايات المتحدة مخولة بإعادة إنتاج وتوزيع طبعات لأغراض حكومية على الرغم من أي تعليق حقوق الطبع والنشر فيه.
Materials
| 0.22 um syringe filter | Milipore Sigma | SLGP033RS | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | |
| 0.75 mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 1 mL syringes | BD | 309628 | |
| 1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) | Sigma-Aldrich | 370533 | |
| 1M Tris-HCI, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15568025 | |
| 27 gauge needles | BD | 305109 | |
| 3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
| 3D-printed centrifuge syringe holder | (custom) | (custom) | |
| Acrylamide solution,40%, for electrophoresis, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A4058-100ML | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Aquapel (fluorinated surface treatment) | Pittsburgh Glass Works | 47100 | |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 139386 | |
| FC-40 fluorinated oil | Sigma-Aldrich | F9755 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | |
| N,N′-Methylenebis(acrylamide) | Sigma-Aldrich | 146072-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Novec-7500 Engineering Fluid (HFE oil) | 3M | 98-0212-2928-5 | |
| polyethylene tubing | Scientific Commodities | B31695-PE/2 | |
| fluorosurfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant | |
| PGMEA developer | Sigma-Aldrich | 484431 | |
| Photomasks | CadArt Servcies | (custom) | |
| Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
| Spin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| Span 80 (sorbitane monooleate) | Sigma-Aldrich | s6760 | |
| SU-8 3025 photoresist | Kayaku | 17030192 | |
| Triton X-100 (octylphenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | t8787 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Sigma-Aldrich | p2287 | |
| Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
| Yeast FWD | IDT | 5′-GCAGACCAGACCAGAACAAA-3′ | |
| Yeast REV | IDT | 5′-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA AC-3 |
|
| Yeast Probe | IDT | 5′-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk FQ/-3′ |
|
| EVOS FL AUTO | Life Technologies | ||
| EVOS LED Cube, GFP | Life Technologies | AMEP4651 | |
| SYLGARD 184 KIT 1.1 LB (PDMS base and curing reagents) | Dow Corning | DC4019862 | |
| TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
| Saccharomyces cerevisiae genomic DNA | Milipore | 69240-3 | |
| Expanded plasma cleaner (plasma bonder) | Harrick Plasma | PDC-002 (230V) | |
References
- Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. Droplet microfluidics: A tool for biology, chemistry, and nanotechnology. Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).
- Gielen, F., et al. Ultrahigh-throughput-directed enzyme evolution by absorbance-activated droplet sorting (AADS). Proceedings of the National Academy of Sciences of USA. 113 (47), 7383-7389 (2016).
- Mai, S., Murphy, T. W., Lu, C. Microfluidics for genome-wide studies involving next generation sequencing. Biomicrofluidics. 11 (2), 021501 (2017).
- Olmedillas-López, S., García-Arranz, M., García-Olmo, D. Current and emerging Applications of Droplet Digital PCR in Oncology. Molecular Diagnosis and Therapy. 21 (5), 493-510 (2017).
- Tong, Y., Shen, S., Jiang, H., Chen, Z. Application of Digital PCR in Detecting Human Diseases Associated Gene Mutation. Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (3), 1718-1730 (2017).
- Yan, Y., et al. Evaluation of droplet digital PCR for non-invasive prenatal diagnosis of phenylketonuria. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (27), 7115-7126 (2019).
- Shang, L., Cheng, Y., Zhao, Y. Emerging Droplet Microfluidics. Chemical Reviews. 117 (12), 7964-8040 (2017).
- The, S., Lin, R., Hung, L., Lee, A. P. Droplet Microfluidics. Lab Chip. 8 (2), 198-220 (2008).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9, 541-544 (2012).
- Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing. Molecular Cell. 58 (4), 610-620 (2015).
- Hatori, M. N., Kim, S. C., Abate, A. R. Particle-Templated Emulsification for Microfluidics-Free Digital Biology. Analytical Chemistry. 90 (16), 9813-9820 (2018).
- Panda, P., et al. Stop-flow lithography to generate cell-laden microgel particles. Lab Chip. 8 (7), 1056-1061 (2008).
- Yozwiak, C. E., Hirschhorn, T., Stockwell, B. R. Towards a microparticle-based system for pooled assays of small molecules in cellular contexts. ACS Chemical Biology. 13 (3), 761-771 (2018).
