Миозин-специфические адаптации анализов подвижности на основе флуоресцентной микроскопии in vitro

Миозины представляют собой моторные белки, которые оказывают силу на актиновые нити, используя энергию, полученную в результате гидролиза аденозинтрифосфата (АТФ)^1. Миозины содержат область головы, шеи и хвоста. Головной домен содержит актин-связывающую область, а также место связывания и гидролиза АТФ. Шейные домены состоят из мотивов IQ, которые связываются с легкими цепями, кальмодулином или кальмодулиноподобными белками^2,3. Хвостовая область имеет несколько функций, специфичных для каждого класса миозинов, включая, но не ограничиваясь, димеризацией двух тяжелых цепей, связыванием молекул груза и регуляцией миозина посредством аутоингибиторных взаимодействий с головными доменами^1.

Подвижные свойства миозина сильно различаются между классами. Некоторые из этих свойств включают коэффициент нагрузки (доля механического цикла миозина, в которой миозин связан с актином) и процессучность (способность двигателя делать несколько шагов на своем пути перед отслоением)^4. Более 40 классов миозинов были определены на основе последовательности анализов^5,6,7,8. Миозины класса 2 классифицируются как «обычные», поскольку они были первыми, которые были изучены; поэтому все другие классы миозинов классифицируются как «нетрадиционные».

Миозин 5а (M5a) является миозином класса 5 и является процессивным двигателем, что означает, что он может делать несколько шагов вдоль актина перед диссоциацией. Он имеет высокий коэффициент полезного действия, что указывает на то, что он проводит большую часть своего механического^цикла,связанного с актином^{9,10,11,12,13,14.} Как и другие миозины, тяжелая цепь содержит N-концевой двигательный домен, который включает в себя как актин-связывание, так и сайт гидролиза АТФ, за которым следует область шеи, которая служит рычагом-рычагом, с шестью мотивами IQ, которые связываются с основными легкими цепями (ELC) и кальмодулином (CaM)^15. Хвостовая область содержит α спиральные спиральные катушки, которые димеризируют молекулу, за которой следует шаровидная хвостовая область для связывания груза. Его кинетика отражает его участие в транспорте меланосом в меланоцитах и эндоплазматического ретикулума в нейронах Пуркинье^16,17. М5а считается прототипом грузового транспортного^{мотора 18.}

Миозины класса 2, или обычные миозины, включают миозины, которые обеспечивают сокращение скелетных, сердечных и гладких мышц в дополнение к немуусочковым изоформам миозина 2 (NM2), NM2a, 2b и 2c^19. Изоформы NM2 находятся в цитоплазме всех клеток и играют общую роль в цитокинезе, адгезии, тканевом морфогенезе и миграции клеток^19,20,21,22. В данной статье обсуждаются обычные протоколы миозина в контексте немузкулового миозина 2b (NM2b)^23. NM2b, по сравнению с M5a, имеет низкий коэффициент нагрузки и ферментарно медленнее с V_max 0,2 с^-123 по сравнению с M5a V_max ≈18 с^-124. Примечательно, что усеченные конструкции NM2b с двумя головками не легко перемещаются процессно на актине; скорее, каждая встреча с актином приводит к силовому удару с последующей диссоциацией молекулы^25.

NM2b содержит две тяжелые цепи миозина, каждая с одним шаровидным головным доменом, одним рычагом-рычагом (с одним ELC и одной регуляторной легкой цепью (RLC)) и α-спиральным спиральным стержнем / хвостовым стержнем, длиной примерно 1 100 аминокислот, который димеризует эти две тяжелые цепи. Ферментативная активность и структурное состояние NM2b регулируются фосфорилированием RLC^23. Нефосфорилированный NM2b, в присутствии АТФ и физиологических ионных сил (приблизительно 150 мМ соли), принимает компактную конформацию, в которой две головки участвуют в асимметричном взаимодействии, а хвостовые складки возвращаются над головами в двух местах^23. В этом состоянии миозин не взаимодействует сильно с актином и обладает очень низкой ферментативной активностью. При фосфорилировании RLC кальмодулин-зависимой миозин-цепной киназой (MLCK) или Rho-ассоциированной протеинкиназой молекула расширяется и связывается с другими миозинами через хвостовую область с образованием биполярных нитей примерно из 30 молекул миозина^23. Вышеупомянутое фосфорилирование RLC также приводит к повышению актин-активированной АТФазной активности NM2b примерно в четыре раза^{в 26,27,28.} Это биполярное расположение нити накала, имеющее множество миозиновых двигателей на каждом конце, оптимизировано для ролей в сжатии и поддержании напряжения, где актиновые нити с противоположными полярностями могут перемещаться относительно друг друга^23,29. Соответственно, было показано, что NM2b действует как ансамбль двигателей при взаимодействии с актином. Большое количество двигателей в этой нити накала позволяют нитям NM2b двигаться процессно на актиновых нитях, что делает возможным характеристику процессичности нити in vitro для^{характеристики 29.}

Хотя был достигнут прогресс в понимании роли миозинов в клетке, необходимо понимать их индивидуальные особенности на уровне белка. Чтобы понять взаимодействия актомиозина на простом уровне белково-белкового взаимодействия, а не внутри клетки, мы можем экспрессировать и очищать рекомбинантные миозины для использования в исследованиях in vitro. Результаты таких исследований затем информируют механобиологов о биофизических свойствах специфических миозидов, которые в конечном итоге управляют сложными клеточными процессами^{12,13,14,25,29.} Как правило, это достигается путем добавления метки аффинности к полноразмерной или усеченной конструкции миозина и очистки с помощью аффинной хроматографии^29,30,31. Кроме того, конструкция может быть спроектирована так, чтобы включать генетически кодируемый флуорофор или метку для маркировки белка синтетическим флуорофором. Добавляя такую флуоресцентную метку, можно проводить исследования визуализации одной молекулы для наблюдения за механикой миозина и кинетикой.

После очищения миозин можно охарактеризовать несколькими способами. Активность АТФазы может быть измерена колориметрическими методами, обеспечивающими понимание общего энергопотребления и актинового сродства двигателя в различных условиях^32. Чтобы узнать о механохимии его подвижности, требуются дальнейшие эксперименты. В этой статье подробно описываются два метода на основе флуоресцентной микроскопии in vitro, которые могут быть использованы для характеристики подвижных свойств очищенного белка миозина.

Первым из этих методов является скользящий актиновый анализ нити, который может быть использован для количественного изучения ансамблевых свойств миозиновых двигателей, а также качественного изучения качества партии очищенного белка^33. Хотя в этой статье обсуждается использование микроскопии полной флуоресценции внутреннего отражения (TIRF) для этого анализа, эти эксперименты могут быть эффективно выполнены с использованием широкопольного флуоресцентного микроскопа, оснащенного цифровой камерой, обычно встречающегося во многих лабораториях^34. В этом анализе насыщающий слой миозиновых двигателей прикрепляется к покровному слипу. Это может быть достигнуто с использованием нитроцеллюлозы, антител, мембран, SiO_{2-производных}поверхностей (таких как триметилхлорсилан), среди прочих^{29,33,35,36,37,38.} Флуоресцентно меченые актиновые нити пропускаются через камеру крышки, на которой актин связывается с миозином, прикрепленным к поверхности. При добавлении АТФ (и киназ при исследовании NM2) камера визуалируется для наблюдения за транслокацией актиновых нитей поверхностно связанными миозинами. Программное обеспечение для отслеживания может использоваться для корреляции скорости и длины каждой скользящей актинной нити. Программное обеспечение для анализа может также обеспечить измерение количества как движущихся, так и стационарных актиновых нитей, что может быть полезно для определения качества данного препарата миозина. Пропорция заглохших нитей также может быть намеренно модулирована поверхностным привязыванием актина к другим белкам и измерена для определения зависимости нагрузки миозина^39. Поскольку каждая нить актина может приводиться в движение большим количеством доступных двигателей, этот анализ очень воспроизводим, причем конечная измеренная скорость устойчива к возмущениям, таким как изменения в начальной концентрации миозина или присутствие дополнительных факторов в растворе. Это означает, что его можно легко модифицировать для изучения активности миозина в различных условиях, таких как измененное фосфорилирование, температура, ионная прочность, вязкость раствора и эффекты нагрузки, вызванной поверхностными тросами. Хотя такие факторы, как сильно связывающие «мертвые головки» миозина, неспособные к гидролизу АТФ, могут вызвать застойные актиновые нити, существует несколько методов, позволяющих смягчить такие проблемы и обеспечить точные измерения. Кинетические свойства миозина сильно различаются в зависимости от классов и, в зависимости от конкретного используемого миозина, скорость скольжения актиновой нити в этом анализе может варьироваться от менее 20 нм / с (миозин 9)^40,41и до 60 000 нм / с(Characean myosin 11)^42.

Второй анализ инвертирует геометрию скользящей актиновой нити^{анализа 12.} Здесь актиновые нити прикрепляются к поверхности покрова и визуализируется движение одиночных молекул M5a или отдельных биполярных нитей NM2b. Этот анализ может быть использован для количественной оценки длины пробега и скоростей отдельных молекул миозина или нитей на актине. Покров покрывается химическим соединением, которое блокирует неспецифическое связывание и одновременно функционализирует поверхность, таким как биотин-полиэтиленгликоль (биотин-ПЭГ). Добавление модифицированных производных авидина затем грунтует поверхность, и биотинилированный актин пропускают через камеру, в результате чего слой F-актина стабильно связывается с нижней частью камеры. Наконец, активированный и флуоресцентно меченый миозин (обычно 1-100 нМ) протекает через камеру, которая затем визуализируется для наблюдения за движением миозина над стационарными актиновым нитями.

Эти модальности представляют собой быстрые и воспроизводимые методы, которые могут быть использованы для изучения динамики как немуечных, так и мышечных миозинов. В этом отчете описываются процедуры очистки и характеристики как M5a, так и NM2b, представляющие собой нетрадиционные и обычные миозины, соответственно. За этим следует обсуждение некоторых миозин-специфических адаптаций, которые могут быть выполнены для достижения успешного захвата движения в двух типах анализа.

Экспрессия и молекулярная биология
КДНК для интересующего миозина должна быть клонирована на модифицированный вектор pFastBac1, который кодирует либо C-концевой FLAG-тег (DYKDDDDK), если экспрессирует M5a-HMM, либо N-концевой FLAG-метки, если экспрессирует полноразмерную молекулу NM2b^{23,43,44,45,46.} C-концевые FLAG-метки на NM2b приводят к ослаблению сродства белка к столбику FLAG-аффинности. Напротив, N-терминально помеченный FLAG белок обычно хорошо связывается с колонкой²³FLAG-аффинности. N-терминально меченый белок сохраняет ферментативную активность, механическую активность и фосфорилирование-зависимую регуляцию^23.

В этой статье использовалась усеченная мышь M5a тяжелая меромиозиновая (HMM)-подобная конструкция с GFP между FLAG-тегом и C-концем тяжелой цепи миозина. Обратите внимание, что в отличие от NM2b, M5a-HMM может быть успешно помечен и очищен с помощью тегов FLAG N- или C-терминала, и в обоих случаях результирующая конструкция будет активной. Тяжелая цепь M5a была усечена при аминокислоте 1090 и содержит три аминокислотных линкера (GCG) между GFP и областью катушки M5a^47. Между GFP и FLAG-тегом не было добавлено дополнительного компоновщика. M5a-HMM был совместно экспрессирован с кальмодулином. Полноразмерная человеческая конструкция NM2b была выражена совместно с ELC и RLC. N-термины RLC сплавлены с GFP через линкер из пяти аминокислот (SGLRS). Непосредственно к FLAG-тегу был прикреплен HaloTag. Между HaloTag и N-концем тяжелой цепи миозина находился линкер, состоящий из двух аминокислот (AS).

Оба препарата миозина очищали от одного литра культуры клеток Sf9, инфицированной бакуловирусом, при плотности примерно 2 х 10⁶ клеток/мл. Объемы бакуловируса для каждой субъединицы зависели от множественности инфекции вируса, определенной инструкциями производителя. В случае M5a клетки были совместно инфицированы двумя различными бакуловирусами – один для кальмодулина и один для тяжелой цепи M5a. В случае NM2b клетки были совместно инфицированы тремя различными вирусами – один для ELC, один для RLC и один для тяжелой цепи NM2b. Для лабораторий, работающих с различными миозинами (или другими многокомплексными белками), этот подход эффективен, поскольку он допускает множество комбинаций тяжелых и легких цепей, а обычно используемые легкие цепи, такие как кальмодулин, могут быть совместно трансфекционированы многими различными тяжелыми цепями миозина. Вся клеточная работа была завершена в шкафу биобезопасности с надлежащей стерильной техникой, чтобы избежать загрязнения.

Для экспрессии как M5a, так и NM2b клетки Sf9, продуцирующие рекомбинантные миозины, собирали через 2-3 дня после заражения путем центрифугирования и хранили при -80 °C. Клеточные гранулы получали центрифугированием коинфицированных клеток Sf9 при 4 °C в течение 30 мин при 2,800 х г. Процесс очистки белка подробно описан ниже.