Adattamenti specifici della miosina dei saggi di motilità basati sulla microscopia a fluorescenza in vitro

Le miosine sono proteine motorie che esercitano forza sui filamenti di actina utilizzando l’energia derivata dall’idrolisi dell’adenosina trifosfato (ATP)¹. Le miosine contengono un dominio della testa, del collo e della coda. Il dominio della testa contiene la regione di legame con l’actina e il sito di legame e idrolisi dell’ATP. I domini del collo sono composti da motivi QI, che si legano a catene leggere, calmodulina o proteine simili a calmoduline^2,3. La regione della coda ha diverse funzioni specifiche per ogni classe di miosine, tra cui, ma non solo, la dimerizzazione di due catene pesanti, il legame delle molecole di carico e la regolazione della miosina tramite interazioni autoinibitorie con i domini della testa¹.

Le proprietà mobili della miosina variano notevolmente tra le classi. Alcune di queste proprietà includono il rapporto di servizio (la frazione del ciclo meccanico della miosina in cui la miosina è legata all’actina) e la processività (la capacità di un motore di fare più passi sul suo binario prima del distacco)⁴. Le oltre 40 classi di miosine sono state determinate sulla base di analisi di sequenza^5,6,7,8. Le miosine di classe 2 sono classificate come “convenzionali” poiché sono state le prime ad essere studiate; tutte le altre classi di miosine sono, quindi, classificate come “non convenzionali”.

La miosina 5a (M5a) è una miosina di classe 5 ed è un motore processivo, il che significa che può fare più passi lungo l’actina prima di dissociarsi. Ha un elevato rapporto di servizio, che indica che trascorre gran parte del suo ciclo meccanico legato all’actina^{9,10,11,12,13,14.} In comune con altre miosine, la catena pesante contiene un dominio motorio N-terminale che include sia un sito di idrolisi dell’actina che un sito di idrolisi dell’ATP seguito da una regione del collo che funge da braccio a leva, con sei motivi QI che si legano alle catene leggere essenziali (ELC) e alla calmodulina (CaM)¹⁵. La regione della coda contiene α bobine arrotolate elicoidali, che dimerizzano la molecola, seguite da una regione di coda globulare per legare il carico. La sua cinetica riflette il suo coinvolgimento nel trasporto dei melanosomi nei melanociti e del reticolo endoplasmatico nei neuroni di Purkinje^16,17. M5a è considerato il prototipo del motore di trasporto merci¹⁸.

Le miosine di classe 2, o le miosine convenzionali, includono le miosine che alimentano la contrazione della muscolatura scheletrica, cardiaca e liscia oltre alle isoforme di miosina 2 (NM2) non muscolare, NM2a, 2b e 2c¹⁹. Le isoforme NM2 si trovano nel citoplasma di tutte le cellule e hanno ruoli condivisi nella citochinesi, nell’adesione, nella morfogenesi tissutale e nella migrazione cellulare^19,20,21,22. Questo articolo discute i protocolli convenzionali della miosina nel contesto della miosina 2b nonmuscolare (NM2b)²³. NM2b, rispetto a M5a, ha un basso rapporto di servizio ed è enzimaticamente più lento con un V_max di 0,2 s^-123 rispetto al V_max di M5a di ≈18 s^-124. In particolare, i costrutti NM2b troncati con due teste non si muovono facilmente processivamente sull’actina; piuttosto, ogni incontro con l’actina si traduce in un colpo di potenza seguito dalla dissociazione della molecola²⁵.

NM2b contiene due catene pesanti di miosina, ciascuna con un dominio della testa globulare, un braccio a leva (con un ELC e una catena leggera regolatoria (RLC)) e un dominio di asta / coda a spirale α-elicoidale, lungo circa 1.100 amminoacidi, che dimerizza queste due catene pesanti. L’attività enzimatica e lo stato strutturale di NM2b sono regolati dalla fosforilazione del RLC²³. NM2b non fosforilato, in presenza di ATP e forze ioniche fisiologiche (circa 150 mM di sale), adotta una conformazione compatta in cui le due teste rendono partecipe un’interazione asimmetrica e la coda si ripiega indietro sopra le teste in due punti²³. In questo stato, la miosina non interagisce fortemente con l’actina e ha un’attività enzimatica molto bassa. Dopo la fosforilazione RLC da parte della miosina chinasi a catena leggera calmodulina-dipendente (MLCK) o chinasi proteica associata a Rho, la molecola si estende e si associa ad altre miosine attraverso la regione della coda per formare filamenti bipolari di circa 30 molecole di miosina²³. La già citata fosforilazione del RLC porta anche ad un aumento dell’attività ATPasi attivata da actina di NM2b di circa quattro volte^26,27,28. Questa disposizione del filamento bipolare, con molti motori a miosina ad ogni estremità, è ottimizzata per ruoli nella contrazione e nel mantenimento della tensione, dove i filamenti di actina con polarità opposte possono essere spostati l’uno rispetto all’altro^23,29. Di conseguenza, NM2b ha dimostrato di agire come un insieme di motori quando interagisce con l’actina. Il gran numero di motori all’interno di questo filamento consente ai filamenti NM2b di muoversi processivamente sui filamenti di actina, rendendo possibile la processività del filamento in vitro per caratterizzare²⁹.

Mentre sono stati fatti progressi nella comprensione del ruolo delle miosine nella cellula, è necessario comprendere le loro caratteristiche individuali a livello proteico. Per comprendere le interazioni dell’actomiosina a un semplice livello di interazione proteina-proteina, piuttosto che all’interno di una cellula, possiamo esprimere e purificare le miosine ricombinanti per l’uso in studi in vitro. I risultati di tali studi informano quindi i meccanobiologi sulle proprietà biofisiche di specifiche miosine che alla fine guidano processi cellulari complessi^{12,13,14,25,29.} Tipicamente, questo si ottiene aggiungendo un tag di affinità a un costrutto di miosina a lunghezza intera o troncato e purificando tramite cromatografia di affinità^29,30,31. Inoltre, il costrutto può essere progettato per includere un fluoroforo geneticamente codificabile o un tag per l’etichettatura delle proteine con un fluoroforo sintetico. Aggiungendo una tale etichetta fluorescente, è possibile eseguire studi di imaging a singola molecola per osservare la meccanica e la cinetica della miosina.

Dopo la purificazione, la miosina può essere caratterizzata in diversi modi. L’attività dell’ATPasi può essere misurata con metodi colorimetrici, fornendo informazioni sul consumo energetico complessivo e sull’affinità con l’actina del motore in diverse condizioni³². Per conoscere la meccanochimica della sua motilità, sono necessari ulteriori esperimenti. Questo documento descrive in dettaglio due metodi in vitro basati sulla microscopia a fluorescenza che possono essere utilizzati per caratterizzare le proprietà mobili di una proteina della miosina purificata.

Il primo di questi metodi è il test del filamento di actina planante, che può essere utilizzato per studiare quantitativamente le proprietà dell’insieme dei motori della miosina, nonché per studiare qualitativamente la qualità di un lotto di proteina^{purificata 33}. Sebbene questo documento discuta l’uso della microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) per questo test, questi esperimenti possono essere eseguiti efficacemente utilizzando un microscopio a fluorescenza ad ampio campo dotato di una fotocamera digitale, comunemente presente in molti laboratori³⁴. In questo test, uno strato saturante di motori a miosina è attaccato a un coverslip. Ciò può essere realizzato utilizzando nitrocellulosa, anticorpi, membrane, superfici derivatizzate da SiO₂(come il trimetilorilclorosilano), tra gli altri^{29,33,35,36,37,38.} I filamenti di actina etichettati fluorescentemente vengono passati attraverso la camera di copertura, su cui l’actina si lega alla miosina attaccata alla superficie. Dopo l’aggiunta di ATP (e chinasi nello studio di NM2), la camera viene emersa per osservare la traslocazione dei filamenti di actina da parte delle miosine legate alla superficie. Il software di tracciamento può essere utilizzato per correlare la velocità e la lunghezza di ciascun filamento di actina planante. Il software di analisi può anche fornire una misura del numero di filamenti di actina sia in movimento che stazionari, che può essere utile per determinare la qualità di un determinato preparato di miosina. La proporzione di filamenti in stallo può anche essere intenzionalmente modulata mediante il legame superficiale dell’actina ad altre proteine e misurata per determinare la dipendenza dal carico della miosina³⁹. Poiché ogni filamento di actina può essere spinto da un gran numero di motori disponibili, questo saggio è molto riproducibile, con la velocità finale misurata che è robusta a perturbazioni come alterazioni nella concentrazione di miosina iniziale o la presenza di fattori aggiuntivi nella soluzione. Ciò significa che può essere facilmente modificato per studiare l’attività della miosina in diverse condizioni, come fosforilazione alterata, temperatura, resistenza ionica, viscosità della soluzione e gli effetti del carico indotto dai ladri superficiali. Sebbene fattori come le “teste morte” di miosina fortemente leganti incapaci di idrolisi dell’ATP possano causare filamenti di actina in stallo, esistono diversi metodi per mitigare tali problemi e consentire misurazioni accurate. Le proprietà cinetiche della miosina variano notevolmente tra le classi e, a seconda della miosina specifica utilizzata, la velocità di scorrimento del filamento di actina in questo test può variare da meno di 20 nm/ s (miosina 9)^40,41e fino a 60.000 nm / s(characean miosina 11)⁴².

Il secondo saggio inverte la geometria del saggio del filamento di actina planante¹². Qui, i filamenti di actina sono attaccati alla superficie del coverslip e viene visualizzato il movimento di singole molecole di M5a o di singoli filamenti bipolari di NM2b. Questo test può essere utilizzato per quantificare le lunghezze e le velocità di corsa di singole molecole di miosina o filamenti su actina. Un coverslip è rivestito con un composto chimico che blocca il legame non specifico e contemporaneamente funzionalizza la superficie, come la biotina-polietilenglicole (biotina-PEG). L’aggiunta di derivati avidici modificati innesca quindi la superficie e l’actina biotinilata viene fatta passare attraverso la camera, risultando in uno strato di F-actina stabilmente legato al fondo della camera. Infine, la miosina attivata ed etichettata fluorescentemente (tipicamente 1-100 nM) viene fatto scorrere attraverso la camera, che viene quindi cioè cioè per osservare il movimento della miosina sui filamenti stazionari di actina.

Queste modalità rappresentano metodi veloci e riproducibili che possono essere impiegati per esaminare la dinamica delle miosine non muscolari e muscolari. Questo rapporto delinea le procedure per purificare e caratterizzare sia M5a che NM2b, che rappresentano rispettivamente miosine non convenzionali e convenzionali. Questo è seguito da una discussione di alcuni degli adattamenti specifici della miosina, che possono essere eseguiti per ottenere una cattura di successo del movimento nei due tipi di test.

Espressione e biologia molecolare
Il cDNA per la miosina di interesse deve essere clonato su un vettore pFastBac1 modificato che codifica per un tag FLAG-terminale C (DYKDDDDK) se esprime M5a-HMM, o un tag FLAG N-terminale se esprime la molecola a lunghezza intera di NM2b^23,43^,44,45,46. I tag FLAG C-terminali su NM2b provocano un’affinità indebolita della proteina per la colonna di affinità FLAG. Al contrario, la proteina N-terminale contrassegnata con FLAG di solito si lega bene alla colonna di affinità FLAG²³. La proteina N-terminalemente marcata mantiene l’attività enzimatica, l’attività meccanica e la regolazione dipendente dalla fosforilazione²³.

In questo articolo, è stato utilizzato un costrutto di meromiosina pesante M5a (HMM) con un GFP tra il tag FLAG e il C-terminus della catena pesante di miosina. Si noti che, a differenza di NM2b, M5a-HMM può essere taggato e purificato con tag FLAG N o C-terminal e in entrambi i casi il costrutto risultante sarà attivo. La catena pesante M5a è stata troncata all’amminoacido 1090 e contiene un linker di tre amminoacidi (GCG) tra la GFP e la regione a spirale dell’M5a^47. Non è stato aggiunto alcun linker aggiuntivo tra il GFP e il tag FLAG. M5a-HMM è stato co-espresso con calmodulin. Il costrutto NM2b umano a lunghezza intera è stato co-espresso con ELC e RLC. L’N-termini del RLC è stato fuso con un GFP tramite un linker di cinque aminoacidi (SGLRS). Direttamente attaccato al flag-tag c’era un HaloTag. Tra l’HaloTag e l’N-terminus della catena pesante della miosina c’era un linker fatto di due amminoacidi (AS).

Entrambi i preparati di miosina sono stati purificati da un litro di coltura cellulare Sf9 infettata da baculovirus ad una densità di circa 2 x 10⁶ cellule / mL. I volumi del baculovirus per ciascuna subunità dipendevano dalla molteplicità di infezione del virus determinata dalle istruzioni del produttore. Nel caso di M5a, le cellule sono state co-infettate con due diversi baculovirus: uno per calmodulin e uno per M5a catena pesante. Nel caso dell’NM2b, le cellule sono state co-infettate con tre diversi virus: uno per eLC, uno per RLC e uno per la catena pesante NM2b. Per i laboratori che lavorano con una varietà di miosine (o altre proteine multi-complesse), questo approccio è efficiente poiché consente molte combinazioni di catene pesanti e leggere e catene leggere comunemente usate come la calmodulina possono essere co-trasfettate con molte diverse catene pesanti di miosina. Tutto il lavoro cellulare è stato completato in un armadio di biosicurezza con una tecnica sterile adeguata per evitare la contaminazione.

Per l’espressione sia di M5a che di NM2b, le cellule Sf9 che producono le miosine ricombinanti sono state raccolte 2-3 giorni dopo l’infezione, tramite centrifugazione, e conservate a -80 °C. I pellet cellulari sono stati ottenuti centrifugando le cellule Sf9 co-infette a 4 °C per 30 minuti a 2.800 x g. Il processo di purificazione delle proteine è dettagliato di seguito.