هنا هو إجراء للتعبير عن وتنقية الميوزين 5a تليها مناقشة توصيفه، وذلك باستخدام كل من الفرقة وجزيء واحد في المختبر مضان المقايسات المستندة إلى المجهر، وكيف يمكن تعديل هذه الأساليب لوصف غير عضلة ميوسين 2b.
بروتينات الميسين ربط والتفاعل مع أكتين خيوط (F-أكتين) وتوجد في الكائنات الحية عبر شجرة phylogenetic. يتم تكييف بنيتها وخصائصها الأنزيمية للوظيفة الخاصة التي تنفذها في الخلايا. Myosin 5a يمشي بشكل عملي على F-actin لنقل الميلانوسومات والحويصلات في الخلايا. وعلى العكس من ذلك، يعمل الميوسين غير العضلي 2b كخيوط ثنائية القطب تحتوي على ما يقرب من 30 جزيء. يتحرك F-actin من القطبية المعاكس نحو وسط خيوط، حيث جزيئات الميوسين تعمل بشكل غير متزامن لربط أكتين، ونقل السكتة الدماغية السلطة، وتفكك قبل تكرار الدورة. غير عضلة ميوزين 2B، جنبا إلى جنب مع غيرها من الميوزين 2 isoforms غير عضلة، والأدوار التي تشمل الالتصاق الخلية، السيتوكينيس، وصيانة التوتر. يمكن دراسة قياس الميوسينيز عن طريق إجراء فحوصات الحركة المختبرية باستخدام البروتينات المنقى. في مقايسة خيوط أكتين المزلقة ، ترتبط الميوسين بسطح غطاء المجهر وتناسل الفلورسنت المسمى F-actin ، والذي يمكن تتبعه. في جزيء واحد / فرقة المقايسة الحركة، ومع ذلك، لا بد F-actin إلى coverlip ويلاحظ حركة جزيئات الميوسين المسمى الفلورسنت على F-actin. في هذا التقرير، يتم تحديد تنقية الميوسين المؤتلف 5a من خلايا Sf9 باستخدام الكروماتوغرافيا التقاربية. بعد ذلك ، نحدد اثنين من المقايسات المستندة إلى المجهر الفلوري: المقايسة خيوط actin المزلقة ونقس الحركة المقلوب. من هذه المقايسات، يمكن استخراج معلمات مثل سرعات نقل أكتين وأطوال وسرعات تشغيل جزيء واحد باستخدام برنامج تحليل الصور. ويمكن أيضا أن تطبق هذه التقنيات لدراسة حركة خيوط واحدة من الميوزين غير العضلي 2 isoforms، التي نوقشت هنا في سياق 2B ميوسين غير عضلي. يمثل سير العمل هذا بروتوكولا ومجموعة من الأدوات الكمية التي يمكن استخدامها لدراسة جزيء واحد وديناميكيات الفرقة من الميوسين غير العضلي.
الميوسين هي البروتينات الحركية التي تمارس القوة على خيوط أكتين باستخدام الطاقة المستمدة من التحلل المائي الأدينوزين ثلاثي الفوسفات (ATP)1. Myosins تحتوي على الرأس والرقبة ، والذيل المجال. يحتوي مجال الرأس على منطقة ربط أكتين بالإضافة إلى موقع ربط ATP والتحلل المائي. وتتكون مجالات الرقبة من الزخارف IQ، والتي ترتبط سلاسل الضوء، كالمودولين، أو كالمودولين مثل البروتينات2،3. منطقة الذيل لديها العديد من الوظائف المحددة لكل فئة من الميوسين، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر إلى تضاؤل سلسلتين ثقيلتين، وربط جزيئات البضائع، وتنظيم الميوسين عن طريق التفاعلات الأوتينهيبيتورية مع نطاقات الرأس1.
خصائص متحركة من الميوسين تختلف اختلافا كبيرا بين الطبقات. وتشمل بعض هذه الخصائص نسبة الواجب (جزء من دورة myosin الميكانيكية التي لا بد أن المايوسين actin) و processivity (قدرة المحرك على اتخاذ خطوات متعددة على مسارها قبل مفرزة)4. تم تحديد أكثر من 40 فئة من الميوسين على أساس تحليلات التسلسل5،6،7،8. تصنف المايوسينات من الفئة 2 على أنها “تقليدية” لأنها كانت أول من درس. جميع الطبقات الأخرى من الميوسين، لذلك، تصنف على أنها “غير تقليدية”.
Myosin 5a (M5a) هو فئة 5 myosin وهو محرك معالجي ، مما يعني أنه يمكن أن يتخذ خطوات متعددة على طول actin قبل الانفصال. لديها نسبة واجب عالية، مما يدل على أنها تنفق جزءا كبيرا من دورتها الميكانيكية ملزمة actin9،10،11،12،13،14. على غرار الميوسينات الأخرى ، تحتوي السلسلة الثقيلة على مجال محرك N-terminal يتضمن كلا من ربط actin وموقع التحلل المائي ATP متبوعا بمنطقة الرقبة التي تعمل كذراع ذراع ، مع ستة زخارف IQ ترتبط بالسلاسل الخفيفة الأساسية (ELC) والكالمودولين (CaM)15. تحتوي منطقة الذيل على α-helical ملفوف-لفائف، والتي تغمغم جزيء، تليها منطقة ذيل كروي للشحن ملزمة. حركيته تعكس مشاركتها في نقل الميلانوسومات في الخلايا الصباغية و الشبكية endoplasmic في الخلايا العصبية Purkinje16,17. ويعتبر M5A نقل البضائع النموذجية المحرك18.
فئة 2 myosins، أو الميوسين التقليدية، وتشمل الميوسين أن تقلص الطاقة من الهيكل العظمي، والقلب، والعضلات الملساء بالإضافة إلى الميوزين غير العضلي 2 (NM2) isoforms، NM2a، 2B، و 2C19. وNM2 isoforms موجودة في السيتوبلازم لجميع الخلايا ولها أدوار مشتركة في السيتوكينيس، التصاق، مورفوجينيسيس الأنسجة، وهجرة الخلايا19،20،21،22. تناقش هذه الورقة بروتوكولات الميوسين التقليدية في سياق الميوزين غير العضلي 2b (NM2b)23. NM2b، بالمقارنة مع M5a، لديها نسبة واجب منخفض وأبطأ أنزيميا معماكس V من 0.2 ق-123 مقارنة ماكسV M5a من ≈18 ق-124. وتجدر الإشارة إلى أن بنيات NM2b المبتورة برأسين لا تتحرك بسهولة بشكل عملي على actin؛ بدلا من ذلك، كل لقاء مع actin النتائج في السكتة الدماغية السلطة تليها فصافر من جزيء25.
NM2b يحتوي على سلسلتين ثقيلتين myosin، كل مع مجال الرأس كروي واحد، واحد رافعة الذراع (مع ELC واحد وسلسلة ضوء تنظيمية واحدة (RLC)،)، وقضيب ملفوف α-helical-لفائف / المجال الذيل، ما يقرب من 1100 الأحماض الأمينية طويلة، أن يقلل من هذه السلسلتين الثقيلة. وينظم النشاط الأنزيمي والدولة الهيكلية من NM2b عن طريق الفوسفور من RLC23. NM2b unphosphorylated، في وجود ATP والقوة الأيونية الفسيولوجية (ما يقرب من 150 mM الملح)، ويعتمد تشكيل المدمجة حيث جعل الرأسين المشاركة في التفاعل غير المتماثل والذيل طيات مرة أخرى فوق رؤوس في مكانين23. في هذه الحالة، لا يتفاعل الميوسين بقوة مع أكتين ولديه نشاط أنزيمي منخفض جدا. على الفوسفور RLC بواسطة كيناز سلسلة ضوء الميوسين المعتمدة على كالمودولين (MLCK) أو كيناز البروتين المرتبط برو ، يمتد الجزيء ويرتبط مع الميوسينات الأخرى عبر منطقة الذيل لتشكيل خيوط ثنائية القطب من حوالي 30 جزيء ميوزين23. الفوسفور المذكورة أعلاه من RLC يؤدي أيضا إلى زيادة النشاط ATPase أكتين تنشيط NM2b من قبل ما يقرب من أربع مرات26،27،28. هذا الترتيب خيوط ثنائي القطب, يضم العديد من المحركات الميوسين في كل نهاية, هو الأمثل لأدوار في انكماش وصيانة التوتر, حيث يمكن نقل خيوط أكتين مع القطبية معارضة بالنسبة لبعضها البعض23,29. وبناء على ذلك، وقد ثبت NM2b لتكون بمثابة مجموعة من المحركات عند التفاعل مع أكتين. العدد الكبير من المحركات داخل هذه خيوط تسمح خيوط NM2b للتحرك بشكل عملي على خيوط أكتين، مما يجعل في عملية خيوط المختبر ممكن لتوصيف29.
في حين تم إحراز تقدم في فهم دور الميوسين في الخلية، هناك حاجة لفهم خصائصها الفردية على مستوى البروتين. لفهم تفاعلات أكتوميوسين على مستوى تفاعل بسيط بين البروتين والبروتين ، بدلا من داخل الخلية ، يمكننا التعبير عن وتنقية الميوسين المؤتلف للاستخدام في الدراسات المختبرية. نتائج مثل هذه الدراسات ثم إبلاغ علماء الأحياء الميكانيكية حول الخصائص الفيزيائية الحيوية من الميوسين محددة التي تدفع في نهاية المطاف العمليات الخلوية المعقدة12،13،14،25،29. عادة، يتم إنجاز ذلك عن طريق إضافة علامة تقارب إلى بناء myosin كامل الطول أو مبتورة وتنقية عبر الكروماتوغرافيا تقارب29،30،31. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن هندسة البناء ليشمل الفلوروفور القابل للتكويد وراثيا أو علامة لوضع العلامات على البروتين مع الفلوروفور الاصطناعي. عن طريق إضافة مثل هذه التسمية الفلورسنت، يمكن إجراء دراسات التصوير جزيء واحد لمراقبة ميكانيكا اليوسين والحركية.
بعد تنقية, يمكن أن تتميز الميسين في عدة طرق. ويمكن قياس النشاط ATPase من خلال أساليب colorimetric، وتوفير نظرة ثاقبة استهلاك الطاقة الشاملة وتقارب أكتين من المحرك تحت ظروف مختلفة32. لمعرفة المزيد عن التماثل الميكانيكي لحركيته ، هناك حاجة إلى مزيد من التجارب. تفصل هذه الورقة طريقتين في المختبر تعتمدان على المجهر الفلوري ويمكن استخدامهما لتوصيف الخصائص المتحركة لبروتين الميوسين المنقى.
أول هذه الطرق هو المقايسة خيوط أكتين المزلقة ، والتي يمكن استخدامها لدراسة الخصائص الكمية لفرقة محركات الميوسين ، وكذلك دراسة جودة دفعة من البروتين النقي33. على الرغم من أن هذه الورقة تناقش استخدام المجهر الكلي الانعكاس الداخلي (TIRF) لهذا المقايسة، يمكن إجراء هذه التجارب بشكل فعال باستخدام مجهر مضان واسع المجال مجهز بكاميرا رقمية، توجد عادة في العديد من المختبرات34. في هذا المقايسة، يتم إرفاق طبقة مشبعة من محركات الميوسين إلى غطاء. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام النيتروسليلوز، والأجسام المضادة، والأغشية، SiO2-اشتقاق السطوح (مثل تريميثيلكلوروسيلين)، من بين أمور أخرى29،33،35،36،37،38. يتم تمرير خيوط أكتين المسمى Fluorescently من خلال غرفة coverslip ، التي يرتبط عليها actin إلى الميوسين المرفق بالسطح. عند إضافة ATP (وkinases في دراسة NM2) ، يتم تصوير الغرفة لمراقبة نقل خيوط الأكتين بواسطة الميوسين المرتبط بالسطح. تتبع البرمجيات يمكن استخدامها لربط سرعة وطول كل مزلق actin خيوط. يمكن أن توفر برامج التحليل أيضا مقياسا لعدد خيوط actin المتحركة والقرطاسية ، والتي يمكن أن تكون مفيدة لتحديد جودة إعداد الميوسين المعطى. ويمكن أيضا أن تكون نسبة خيوط المتوقفة عمدا تحويرها الربط السطحي من أكتين إلى البروتينات الأخرى وقياسها لتحديد الاعتماد على تحميل من39الميوسين . لأن كل خيوط أكتين يمكن أن تدفعها عدد كبير من المحركات المتاحة، وهذا المقايسة قابلة للاستنساخ جدا، مع السرعة النهائية المقاسة يجري قوية للاضطرابات مثل التعديلات في تركيز الميوسين بدءا أو وجود عوامل إضافية في الحل. وهذا يعني أنه يمكن تعديلها بسهولة لدراسة نشاط الميوسين في ظل ظروف مختلفة، مثل الفوسفور المتغيرة، ودرجة الحرارة، والقوة الأيونية، و لزوجة الحل، وآثار الحمل الناجم عن الحبال السطحية. على الرغم من أن عوامل مثل الميسين قوية الربط “رؤساء القتلى” غير قادر على التحلل المائي ATP يمكن أن يسبب خيوط أكتين المتوقفة، توجد أساليب متعددة للتخفيف من هذه القضايا والسماح لقياسات دقيقة. خصائص الحركية من الميوسين تختلف اختلافا كبيرا عبر الطبقات، واعتمادا على الميسين محددة المستخدمة، وسرعة مزلق خيوط أكتين في هذا المقايسة يمكن أن تختلف من أقل من 20 نانومتر / ثانية (myosin 9)40،41،وحتى 60،000 نانومتر / ثانية (Characean myosin 11)42.
المقايسة الثانية عكس هندسة مزلق actin خيوط المقايسة12. هنا ، يتم إرفاق خيوط الأكتين بسطح الغطاء ويتم تصور حركة جزيئات واحدة من M5a أو خيوط ثنائية القطب فردية من NM2b. يمكن استخدام هذا المقايسة لتحديد أطوال وسرعات تشغيل جزيئات الميوسين المفردة أو خيوطها على actin. غطاء مغطى بمجمع كيميائي يمنع الربط غير المحدد ويميز السطح في نفس الوقت، مثل البيوتين البولي إيثيلين غليكول (البيوتين-PEG). إضافة مشتقات avidin المعدلة ثم يعبي السطح ويتم تمرير أكتين البيوتينات من خلال الغرفة، مما أدى إلى طبقة من F-actin ملزمة بشكل ثابت إلى أسفل الغرفة. وأخيرا، يتم تدفق الميوسين المنشط والمسمي بالفلورسنت (عادة 1-100 nM) من خلال الغرفة، والتي يتم تصويرها بعد ذلك لمراقبة حركة الميوسين فوق خيوط الأكتين الثابتة.
تمثل هذه الطرائق أساليب سريعة وقابلة للاستنساخ يمكن استخدامها لدراسة ديناميكيات كل من الميوسين غير العضلي والعضلات. يحدد هذا التقرير الإجراءات لتنقية وتوصيف كل من M5a و NM2b ، مما يمثل الميوسين غير التقليدي والتقليدي ، على التوالي. ويلي ذلك مناقشة لبعض التعديلات الخاصة بالميسين، والتي يمكن إجراؤها لتحقيق التقاط الحركة بنجاح في نوعي المقايسة.
التعبير والبيولوجيا الجزيئية
يجب استنساخ cDNA لmيوزين من الفائدة على ناقلات pFastBac1 المعدلة التي ترميز إما لC-محطة FLAG-tag (DYKDDDDK) إذا كان التعبير عن M5a-HMM, أو علامة FLAG N-المحطة إذا أعرب عن جزيء كامل الطول من NM2b23,43,44,45,46. C-محطة FLAG-العلامات على NM2b النتائج في تقارب ضعف البروتين للعمود العلم تقارب. في المقابل، البروتين N-terminally FLAG الموسومة عادة يربط جيدا إلى العمود العلم تقارب23. يحتفظ البروتين الموسوم بشكل نهائي بالنشاط الأنزيمي والنشاط الميكانيكي والتنظيم المعتمد على الفوسفور23.
في هذه الورقة، تم استخدام ماوس مبتور M5a meromyosin الثقيلة (HMM) مثل بناء مع GFP بين العلامة FLAG وC-terminus من سلسلة الميوزين الثقيلة. لاحظ أنه على عكس NM2b، يمكن وضع علامة على M5a-HMM بنجاح وتنقيته باستخدام علامات FLAG N-أو C-terminal وفي كلتا الحالتين سيكون البناء الناتج نشطا. تم اقتطاع سلسلة M5a الثقيلة في الأحماض الأمينية 1090 ويحتوي على ثلاثة وصلة الأحماض الأمينية (GCG) بين GFP ومنطقة ملفوف لفائف من M5a47. لم يتم إضافة رابط إضافي بين GFP و FLAG-tag. M5a-HMM شارك في التعبير مع كالمودولين. وقد شارك في التعبير عن بناء NM2b البشري الكامل الطول مع ELC و RLC. تم دمج N-termini من RLC مع GFP عبر رابط من خمسة أحماض أمينية (SGLRS). تعلق مباشرة إلى العلامة FLAG كان HaloTag. بين هالوتاغ والنهاء ن من سلسلة الميسين الثقيلة كان رابط مصنوع من اثنين من الأحماض الأمينية (AS).
تم تنقية كل من الاستعدادات الميوسين من لتر واحد من ثقافة الخلية Sf9 المصابة بفيروس baculo في كثافة حوالي 2 × 106 خلايا / مل. تعتمد أحجام الفيروس الكولو لكل وحدة فرعية على تعدد عدوى الفيروس كما تحددها تعليمات الشركة المصنعة. في حالة M5a ، كانت الخلايا مصابة بفيروسين باكولو مختلفين – واحد للكالمودولين ، وواحد لسلسلة M5a الثقيلة. في حالة NM2b ، كانت الخلايا مصابة بثلاثة فيروسات مختلفة – واحد ل ELC ، واحد ل RLC ، وواحد لسلسلة NM2b الثقيلة. للمختبرات التي تعمل مع مجموعة متنوعة من الميوسين (أو غيرها من البروتينات متعددة التعقيد)، وهذا النهج هو كفاءة لأنه يسمح للعديد من تركيبات من سلاسل الثقيلة والخفيفة والسلاسل الخفيفة المستخدمة عادة مثل كالمودولين يمكن أن تكون مشتركة مع العديد من سلاسل ثقيلة myosin مختلفة. تم الانتهاء من جميع أعمال الخلية في خزانة السلامة البيولوجية مع تقنية معقمة مناسبة لتجنب التلوث.
للتعبير عن كل من M5a و NM2b ، تم جمع خلايا Sf9 المنتجة للميوسين المؤتلف بعد يومين إلى 3 أيام من العدوى ، عن طريق الطرد المركزي ، وتخزينها عند -80 درجة مئوية. تم الحصول على الكريات الخلية عن طريق الطرد المركزي خلايا SF9 المصابة في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في 2800 × ز. يتم تفصيل عملية تنقية البروتين أدناه.
هنا هو سير العمل لتنقية وتوصيف في المختبر من 5a ميوزين و2b غير عضلة ميوسين. هذه المجموعة من التجارب مفيدة لتحديد الخصائص الميكانيكية الكيميائية لبنى الميوسين المنقى بطريقة سريعة وقابلة للاستنساخ. على الرغم من أن اثنين من الميوسين هو مبين هنا ليست سوى مثالين محددين من بين العديد من الاحتمال?…
The authors have nothing to disclose.
ونشكر الدكتور فانغ زانغ على المساعدة التقنية في إعداد الكواشف المستخدمة لجمع هذه البيانات. تم دعم هذا العمل من قبل NHLBI / NIH صندوق برنامج البحوث داخل الجافية HL001786 إلى J.R.S.
1 mL Syringe | BD | 309628 | |
2 M CaCl2 Solution | VWR | 10128-558 | |
2 M MgCl2 Solution | VWR | 10128-298 | |
27 Gauge Needle | Becton Dickinson | 309623 | |
5 M NaCl Solution | KD Medical | RGE-3270 | |
Acetic Acid | ThermoFisher Scientific | 984303 | |
Amyl Acetate | Ladd Research Industries | 10825 | |
Anti-FLAG M2 Affinity Gel | Millipore Sigma | A2220 | https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf |
ATP | Millipore Sigma | A7699 | |
Biotinylated G-Actin | Cytoskeleton, Inc. | AB07 | |
Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | 5470 | |
bPEG-silane | Laysan Bio, Inc | Biotin-PEG-SIL-3400-1g | |
Bradford Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | |
Calmodulin | PMID: 2985564 | ||
Catalase | Millipore Sigma | C40 | |
Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 11496015 | http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf |
Circular Filter Paper – Gliding Assay | Millipore Sigma | WHA1001125 | |
Circular Filter Paper – Inverted Assay | Millipore Sigma | WHA1001090 | |
cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor Tablets | Millipore Sigma | 5056489001 | This should be stored at 4 °C. The tablets can be used directly or can be reconstituted as a 25x stock solution by dissolving 1 tablet in 2 mL of distilled water. The resulting solution can be stored at 4 °C for 1-2 weeks or at least 12 weeks at -20 °C. |
Concentrating Tubes (100,000 MWCO) | EMD Millipore Corporation | UFC910024 | The MWCO of the tube is not necessarily "one size fits all," as long as the MWCO is less than the total molecular weight of the protein being purified. The NM2b herein was concentrated with a 100,000 MWCO tube and the M5a was concentrated with a 30,000 MWCO tube. |
Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye | ThermoFisher Scientific | 20278 | |
Coverslip Rack | Millipore Sigma | Z688568-1EA | |
Coverslips: Gliding Acting Filament Assay | VWR International | 48366-227 | |
Coverslips: Inverted Motility Assay | Azer Scientific | ES0107052 | |
Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO) | Fischer Scientific | 08-670-5A | The diameter of the dialysis tube can vary, but the MWCO should be the same. The NM2b used herein was dialyzed in an 18 mm dialysis tube. The tubes can be stored in 20% alcohol solution at 4 °C. |
DL-Dithiothreitol | Millipore Sigma | D0632 | |
Double-Sided Tape | Office Depot | 909955 | |
DYKDDDDK Peptide | GenScript | RP10586 | This can be dissolved in a buffer containing 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3, and 10 mM MOPS (pH 7.2) to a final concentration of 50 mg/mL. This can be stored at -20 °C as 300 µL aliquots. |
EGTA | Millipore Sigma | E4378 | |
Elution Column | Bio-Rad | 761-1550 | These can be reused. To clean, rinse the column with 2-3 column volumes of PBS and distilled water. Chill the column at 4° C before use. |
Ethanol | Fischer Scientific | A4094 | |
G-actin | PMID: 4254541 | G-actin stock can be stored at 200 μM in liquid N2. | |
Glucose | Millipore Sigma | G8270 | |
Glucose Oxidase | Millipore Sigma | G2133 | |
Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L | Santa Cruz Biotechnology | sc-295018 | |
HaloTag | Promega | G100A | |
HCl | Millipore Sigma | 320331 | |
KCl | Fischer Scientific | P217-500 | |
Large-Orifice Pipet Tips | Fischer Scientific | 02-707-134 | |
Leupeptin Protease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 78435 | |
Mark12 Unstained Standard Ladder | ThermoFisher Scientific | LC5677 | |
Methanol | Millipore Sigma | MX0482 | |
Methylcellulose | Millipore Sigma | M0512 | |
Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-553-10 | |
MOPS | Fischer Scientific | BP308-100 | |
mPEG-silane | Laysan Bio, Inc | MPEG-SIL-2000-1g | |
Myosin Light Chain Kinase | PMID: 23148220 | FLAG-tagged MLCK can be purified the same way that the FLAG-tagged myosin was purified herein. | |
NaN3 | Millipore Sigma | S8032 | |
NeutrAvidin | ThermoFisher Scientific | 31050 | |
Nitrocellulose | Ladd Research Industries | 10800 | |
NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-well | ThermoFisher Scientific | NP0323PK2 | |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | |
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
PMSF | Millipore Sigma | 78830 | PMSF can be made as a 0.1 M stock solution in isopropanol and stored in 4 °C. Isopropanol addition results in crystal precipitation, which can be dissolved by stirring at room temperature. Immediately before use, PMSF can be added dropwise to a rapidly stirring solution to a final concentration of 0.1 mM. |
Razor Blades | Office Depot | 397492 | |
Rhodamine-Phalloidin | ThermoFisher Scientific | R415 | Stock can be diluted in 100% methanol to a final concentration of 200 μM. |
Sf9 Media | ThermoFisher Scientific | 12658-027 | This should be stored at 4° C. Its shelf life is 18 months from the date of manufacture. |
Tissue Culture Dish – Gliding Assay | Corning | 353025 | Each tissue culture dish can hold approximately nine coverslips. |
Tissue Culture Dish – Inverted Assay | Corning | 353003 | Each tissue culture dish can hold approximately four coverslips. |
Smooth-sided 200 µL Pipette Tips | Thomas Scientific | 1158U38 | |
EQUIPMENT | |||
Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75006590 | |
Microscope | Nikon | Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100x TIRF Objective (N.A. 1.49) | |
Microscope Camera | Andor | Model: iXon DU888 EMCCD camera (1024 x 1024 sensor format) | |
Microscope Environmental Control Box | Tokai HIT | Custom Thermobox | |
Microscope Laser Unit | Nikon | LU-n4 four laser unit with solid state lasers for 405nm, 488nm, 561nm,and 640nm | |
Mid Bench Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Model: CR3i | |
Misonix Sonicator | Misonix | XL2020 | |
Optima Max-Xp Tabletop Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
Plasma-Cleaner | Diener electronic GmbH + Co. KG | System Type: Zepto | |
Sonicator Probe (3.2 mm) | Qsonica | 4418 | |
Standard Incubator | Binder | Model: 56 | |
Waverly Tube Mixer | Waverly | TR6E | |
SOFTWARE | |||
ImageJ FIJI | https://imagej.net/Fiji/Downloads | ||
FAST (Version 1.01) | http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements | FAST is available for Mac OSX and Linux based systems. | |
Image Stabilizer Plugin | https://imagej.net/Image_Stabilizer | ||
ImageJ TrackMate | https://imagej.net/TrackMate | ||
Imaging Software | NIS Elements (AR package) | ||
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html | |||
File:TrackMate-manual.pdf | |||
https://github.com/turalaksel/FASTrack | |||
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md |