İn vitro Floresan Mikroskopi Bazlı Hareketlilik Testlerinin Miyosin'e Özgü Uyarlamaları

Miyosinler, adenozin trifosfat (ATP) hidrolizi^1’denelde edilen enerjiyi kullanarak aksin filamentlerine güç uygulayan motor proteinlerdir. Miyozinler bir baş, boyun ve kuyruk alanı içerir. Baş etki alanı, aksin bağlama bölgesinin yanı sıra ATP bağlama ve hidroliz alanını içerir. Boyun etki alanları, hafif zincirlere, calmodulin veya calmodulin benzeri proteinlere bağlanan IQ motiflerinden oluşur^2,3. Kuyruk bölgesi, iki ağır zincirin küçültmesi, kargo moleküllerinin bağlanması ve miyosin’in baş etki alanlarıyla otoinhibitory etkileşimleri yoluyla düzenlenmesi dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere her miyosin sınıfına özgü çeşitli işlevlere sahiptir¹.

Miyozin’in hareketli özellikleri sınıflar arasında büyük ölçüde değişir. Bu özelliklerden bazıları görev oranını (miyosin’in hareket etmeye bağlı olduğu mekanik döngüsünün fraksiyonu) ve süreçselliği (bir motorun ayrılmadan önce pistinde birden fazla adım atma yeteneği)⁴. 40’ın üzerinde miyozin sınıfı sıra analizleri⁵, 6^,7,8esas alınarak belirlenmiştir. Sınıf 2 miyozinler, ilk çalışılanlar oldukları için “geleneksel” olarak sınıflandırılır; Bu nedenle, diğer tüm miyozin sınıfları “alışılmadık” olarak sınıflandırılır.

Myosin 5a (M5a) sınıf 5 miyozindir ve bir işlem motorudur, yani ayrışmadan önce aktüer boyunca birden fazla adım atabilir. Mekanik döngüsünün büyük bir kısmını 9 , 10 , 11 ,^12,13,14. Diğer miyosinlerle ortak olarak, ağır zincir, hem aksin bağlama hem de ATP hidroliz bölgesini ve ardından temel ışık zincirlerine (ELC) ve calmodulin (CaM)^15’ebağlanan altı IQ motifi ile kol kolu görevi gören bir boyun bölgesini içeren bir N-terminal motor etki alanı içerir. Kuyruk bölgesi, molekülü küçülten α sarmal sarmallar ve ardından yükü bağlamak için küresel bir kuyruk bölgesi içerir. Kinetiği, melanositlerdeki melanozomların ve Purkinje nöronlarındaki endoplazmik retikulumun taşınmasındaki rolünü yansıtır^16,17. M5a prototipik kargo taşıma motoru¹⁸olarak kabul edilir.

Sınıf 2 miyozinler veya geleneksel miyozinler, iskelet, kardiyak ve düz kasın güç kasılmasını sağlayan miyozinleri içerir, nonmuscle miyozin 2 (NM2) izoformlarına ek olarak, NM2a, 2b ve 2c¹⁹. NM2 izoformları tüm hücrelerin sitoplazmasında bulunur ve sitokin, yapıştırma, doku morfogenez ve hücre^{göçünde 19,}20 ,^21,22ortak rollere sahiptir. Bu makalede, nonmuscle myosin 2b (NM2b)²³bağlamında geleneksel miyozin protokolleri tartışılmaktadır. NM2b, M5a’ya kıyasla düşük bir görev oranına sahiptir ve M ≈5a’nın V _maks. Özellikle, iki başlı kesilmiş NM2b yapıları, aktiin üzerinde işlemsel olarak kolayca hareket etmez; bunun yerine, aktivin ile her karşılaşma, molekülün ayrışması ile takip eden bir güç vuruşu ile sonuçlanır²⁵.

NM2b, her biri bir küresel kafa etki alanına sahip iki miyozin ağır zincir, bir kol kolu (bir ELC ve bir düzenleyici ışık zinciri (RLC) ve bu iki ağır zinciri küçülten yaklaşık 1.100 amino asit uzunluğunda α sarmal bobin çubuğu / kuyruk etki alanı içerir. NM2b’nin enzymatic aktivitesi ve yapısal durumu RLC^23’ünfosforilasyonu ile düzenlenir. Fosforilasyonsuz NM2b, ATP ve fizyolojik iyonik güçlü yönlerin (yaklaşık 150 mM tuz) varlığında, iki kafanın asimetrik bir etkileşime katıldığı ve kuyruğun iki yerde kafaların üzerine geri katlandığı kompakt bir uygunluk benimser²³. Bu durumda, miyozin aktiz ile güçlü bir şekilde etkileşime girmez ve çok düşük enzimmatik aktiviteye sahiptir. Calmodulin bağımlı miyosin ışık zinciri kinaz (MLCK) veya Rho ile ilişkili protein kinazı ile RLC fosforilasyonu üzerine, molekül yaklaşık 30 miyozin molekülünün bipolar filamentlerini oluşturmak için kuyruk bölgesinde diğer miyozinlerle genişler ve ilişkilendirir²³. RLC’nin yukarıda belirtilen fosforilasyonu, NM2b’nin aksinle aktive atpase aktivitesinin yaklaşık dört kat artmasına neden oluyor^26,27,28. Her iki ucunda birçok miyozin motoru bulunan bu bipolar filament düzenlemesi, karşı kutuplara sahip aktüer filamentlerin birbirine göre hareket ettirilebildiği kasılma ve gerilim bakımındaki roller için optimize edilmiştir^23,29. Buna göre, NM2b’nin actin ile etkileşime girerken bir motor topluluğu olarak hareket ettiği gösterilmiştir. Bu filament içindeki çok sayıda motor, NM2b filamentlerinin aktüer filamentler üzerinde işlemsel olarak hareket etmesine izin verir, bu da in vitro filament sürecini karakterize etmeyi mümkün hale getirir²⁹.

Miyozinlerin hücredeki rolünü anlamada ilerleme kaydedilirken, protein düzeyinde bireysel özelliklerinin anlaşılmasına ihtiyaç vardır. Aktomiyosin etkileşimlerini bir hücrenin içinde değil, basit bir protein-protein etkileşim düzeyinde anlamak için, in vitro çalışmalarda kullanılmak üzere rekombinant miyosinleri ifade edebilir ve saflaştırabiliriz. Bu tür çalışmaların sonuçları daha sonra mechanobiyologları karmaşık hücresel süreçleri yönlendiren spesifik miyosinlerin biyofiziksel özellikleri hakkında bilgilendirir^{12 , 13,14,25,29}. Tipik olarak, bu, tam uzunlukta veya kesilmiş bir miyozin yapısına benzeşim etiketi eklenerek ve benzeşim kromatografisi^29,30^,31ile arındırılarak gerçekleştirilir. Ek olarak, yapı genetik olarak kodlanabilir bir florofor veya sentetik bir florofor ile protein etiketleme etiketi içerecek şekilde tasarlanmıştır. Böyle bir floresan etiket eklenerek miyosin mekaniği ve kinetiği gözlemlemek için tek moleküllü görüntüleme çalışmaları yapılabilir.

Saflaştırmadan sonra, miyozin çeşitli şekillerde karakterize edilebilir. ATPase aktivitesi kolorimetrik yöntemlerle ölçülebilir, motorun farklı koşullar altında genel enerji tüketimi ve aktüen benzeşimi hakkında fikir sağlar³². Hareketliliğinin mekanokmemetrisi hakkında bilgi edinmek için daha fazla deney yapılması gerekir. Bu makalede, saflaştırılmış bir miyosin proteininin hareketli özelliklerini karakterize etmek için kullanılabilecek iki in vitro floresan mikroskopi tabanlı yöntem ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Bu yöntemlerden ilki, miyozin motorlarının topluluk özelliklerini nicel olarak incelemek ve bir grup saflaştırılmış proteinin kalitesini niteliksel olarak incelemek için kullanılabilecek kayma aktinin filament tahlil^{tahlilidir 33}. Bu makalede bu test için toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopisinin kullanımı tartışılsa da, bu deneyler birçok laboratuvarda yaygın olarak bulunan dijital kamera ile donatılmış geniş alan floresan mikroskobu kullanılarak etkili bir şekilde gerçekleştirilebilir³⁴. Bu testte, bir kapak kapağına doygun bir miyozin motor tabakası tutturulur. Bu, nitroselüloz, antikorlar, zarlar, SiO₂türetilmiş yüzeyler (trimetilchlorosilane gibi), diğerleri²⁹, 33^,35,36,37,38kullanılarak gerçekleştirilebilir. Floresan etiketli aktisin filamentleri, akinin yüzeye bağlı miyosin’e bağlandığı kapak odasından geçirilir. ATP (ve NM2 çalışmasındaki kinazlar) ek olarak, oda yüzeye bağlı miyozinler tarafından aktiin filamentlerinin translokasyonunun gözlemlenmesi için resmedilir. İzleme yazılımı, her bir kayma eyleminin hızını ve uzunluğunu ilişkilendirmek için kullanılabilir. Analiz yazılımı ayrıca, belirli bir miyozin preparatının kalitesini belirlemek için yararlı olabilecek hem hareketli hem de sabit aktüer filamentlerinin sayısının bir ölçüsünü sağlayabilir. Durmuş filamentlerin oranı, aktin yüzeyinin diğer proteinlere bağlanmasıyla kasıtlı olarak modüle edilebilir ve miyozin^39’unyük bağımlılığını belirlemek için ölçülebilir. Her aktüen filament çok sayıda mevcut motor tarafından itilebildiğinden, bu test çok tekrarlanabilir, son ölçülen hız başlangıç miyozin konsantrasyonundaki değişiklikler veya çözeltideki ek faktörlerin varlığı gibi pertürbasyonlara karşı sağlamdır. Bu, değiştirilmiş fosforilasyon, sıcaklık, iyonik mukavemet, çözelti viskozitesi ve yüzey tetherlerinin neden olduğu yükün etkileri gibi farklı koşullar altında miyozin aktivitesini incelemek için kolayca değiştirilebileceği anlamına gelir. ATP hidrolizden aciz güçlü bağlayıcı miyozin “ölü kafalar” gibi faktörler duran aksin filamentlerine neden olsa da, bu tür sorunları azaltmak ve doğru ölçümlere izin vermek için birden fazla yöntem mevcuttur. Miyozinin kinetik özellikleri sınıflar arasında büyük ölçüde değişir ve kullanılan spesifik miyozinlere bağlı olarak, bu testte süzülen aktüer filament hızı 20 nm / s (miyozin 9) 40^,41ve 60.000 nm / s ‘ye (Characean myosin 11)⁴²‘ye kadar değişebilir.

İkinci test, kayma aktinin geometrisini tersine çevirir filament¹². Burada, aktisin filamentleri kapak yüzeyine tutturulur ve M5a’nın tek moleküllerinin veya NM2b’nin bireysel bipolar filamentlerinin hareketi görselleştirilir. Bu test, actin üzerindeki tek miyozin moleküllerinin veya filamentlerinin çalışma uzunluklarını ve hızlarını ölçmek için kullanılabilir. Bir kapak, spesifik olmayan bağlamayı engelleyen ve aynı zamanda biyotin-polietilen glikol (biotin-PEG) gibi yüzeyi işlevselleştiren kimyasal bir bileşikle kaplanır. Modifiye avidin türevlerinin eklenmesi daha sonra yüzeyi astarlar ve biyotinillenmiş aktin hazneden geçirilir, bu da odanın dibine bağlı bir F-aktin tabakası ile sonuçlanır. Son olarak, aktif ve floresan etiketli miyosin (tipik olarak 1-100 nM) hazneden akar, daha sonra sabit aksin filamentleri üzerinde miyosin hareketini gözlemlemek için görüntülenmiştir.

Bu yöntemler, hem nonmuscle hem de kas miyozinlerinin dinamiklerini incelemek için bunların kullanılabileceği hızlı ve tekrarlanabilir yöntemleri temsil eder. Bu rapor, sırasıyla alışılmadık ve geleneksel miyozinleri temsil eden hem M5a hem de NM2b’yi arındırma ve karakterize etme prosedürlerini özetlemektedir. Bunu, tahlilin iki tipinde hareketin başarılı bir şekilde yakalanmasını sağlamak için gerçekleştirilebilen miyozine özgü uyarlamalardan bazılarının tartışılması takip eder.

İfade ve moleküler biyoloji
İlgi miyozin için cDNA, M5a-HMM’yi ifade ediyorsa C terminali BAYRAK etiketi (DYKDDDDK) veya NM2b²³, 43 , 44 ,^45,46tam uzunluk moleküllerini ifade ediyorsa bir N-terminal FLAG-tag için kodlanan değiştirilmiş bir pFastBac1 vektörüne klonlanmalıdır. NM2b’deki C-terminal FLAG etiketleri, FLAG benzeşimi sütunu için proteinin zayıflamış bir benzeşimiyle sonuçlanır. Buna karşılık, N-terminally FLAG etiketli protein genellikle FLAG benzeşimi sütunu^23’eiyi bağlanır. N-terminal etiketli protein enzmatik aktiviteyi, mekanik aktiviteyi ve fosforilasyona bağlı düzenlemeyi korur²³.

Bu yazıda, FLAG etiketi ile miyosin ağır zincirinin C-terminusu arasında GFP bulunan kesilmiş bir fare M5a ağır meromyosin (HMM) benzeri bir yapı kullanılmıştır. NM2b’den farklı olarak, M5a-HMM’nin N veya C terminali FLAG etiketleriyle başarıyla etiketlenebilir ve saflaştırılabilir ve her iki durumda da sonuçta elde edilen yapının etkin olacağını unutmayın. M5a ağır zinciri amino asit 1090’da kesilmiştir ve GFP ile M5a^47’ninsarmal bobin bölgesi arasında üç amino asit bağlayıcı (GCG) içerir. GFP ve FLAG etiketi arasına ek bağlayıcı eklenmedi. M5a-HMM calmodulin ile birlikte ifade edildi. Tam boy insan NM2b yapısı ELC ve RLC ile birlikte ifade edildi. RLC’nin N-termini, beş amino asit (SGLRS) bağlayıcısı aracılığıyla bir GFP ile kaynaştırıldı. FLAG etiketine doğrudan iliştirilmiş bir HaloTag idi. HaloTag ve miyosin ağır zincirinin N-terminusları arasında iki amino asit (AS) yapılmış bir bağlayıcı vardı.

Her iki miyozin preparatı da yaklaşık 2 x 10⁶ hücre/mL yoğunlukta baculovirüs ile enfekte olmuş bir litre Sf9 hücre kültüründen arındırıldı. Her alt birim için baculovirüs hacimleri, üreticinin talimatlarıyla belirlenen virüsün enfeksiyon çokluğuna bağlıydı. M5a durumunda, hücrelere calmodulin için iki farklı baculovirus-bir ve M5a ağır zinciri için bir tane ile birlikte enfekte edildi. NM2b durumunda, hücrelere ELC için üç farklı virüs-bir, RLC için bir ve NM2b ağır zinciri için bir virüs bulaştı. Çeşitli miyosinlerle (veya diğer çok karmaşık proteinlerle) çalışan laboratuvarlar için bu yaklaşım, ağır ve hafif zincirlerin ve calmodulin gibi yaygın olarak kullanılan hafif zincirlerin birçok kombinasyonuna izin verdiğinden, birçok farklı miyosin ağır zinciri ile birlikte trans enfekte edilebilir. Tüm hücre çalışmaları, kontaminasyonu önlemek için uygun steril teknikle biyogüvenlik kabininde tamamlandı.

Hem M5a hem de NM2b’nin ekspresyonu için, rekombinant miyozinleri üreten Sf9 hücreleri, santrifüjleme yoluyla enfeksiyondan 2-3 gün sonra toplandı ve -80 °C’de depolandı. Hücre topakları, 4 °C’de 2.800 x g’da30 dakika boyunca birlikte enfekte olmuş Sf9 hücrelerinin santrifüj edilmesiyle elde edildi. Protein saflaştırma işlemi aşağıda ayrıntılı olarak verilmiştir.