Adaptaciones específicas de miosina de ensayos de motilidad basados en microscopía de fluorescencia in vitro

Las miosinas son proteínas motoras que ejercen fuerza sobre los filamentos de actina utilizando la energía derivada de la hidrólisis de trifosfato de adenosina (ATP)¹. Las miosinas contienen un dominio de cabeza, cuello y cola. El dominio de la cabeza contiene la región de unión a la actina, así como el sitio de unión al ATP y la hidrólisis. Los dominios del cuello están compuestos de motivos de CI, que se unen a cadenas ligeras, calmodulina o proteínas similares a la calmodulina^2,3. La región de la cola tiene varias funciones específicas para cada clase de miosinas, que incluyen, entre otras, la dimerización de dos cadenas pesadas, la unión de moléculas de carga y la regulación de la miosina a través de interacciones autoinhibitorias con los dominios de la cabeza¹.

Las propiedades móviles de la miosina varían mucho entre las clases. Algunas de estas propiedades incluyen la relación de trabajo (la fracción del ciclo mecánico de la miosina en la que la miosina se une a la actina) y la procesividad (la capacidad de un motor para hacer múltiples pasos en su pista antes del desprendimiento)⁴. Las más de 40 clases de miosinas se determinaron en base a análisis de secuencia^5,6,7,8. Las miosinas de clase 2 se clasifican como “convencionales” ya que fueron las primeras en ser estudiadas; todas las demás clases de miosinas se clasifican, por lo tanto, como “no convencionales”.

La miosina 5a (M5a) es una miosina de clase 5 y es un motor procesivo, lo que significa que puede tomar múltiples pasos a lo largo de la actina antes de disociarse. Tiene una alta relación de trabajo, lo que indica que pasa gran parte de su ciclo mecánico unido a la actina^{9,10,11,12,13,14.} Al igual que otras miosinas, la cadena pesada contiene un dominio motor N-terminal que incluye tanto una unión a la actina como un sitio de hidrólisis de ATP seguido de una región del cuello que sirve como brazo de palanca, con seis motivos de CI que se unen a las cadenas ligeras esenciales (ELC) y la calmodulina (CaM)¹⁵. La región de la cola contiene α bobinas enrolladas semilicoidales, que dimerizan la molécula, seguidas de una región de cola globular para unir la carga. Su cinética refleja su implicación en el transporte de melanosomas en los melanocitos y del retículo endoplásmico en las neuronas de Purkinje^16,17. M5a se considera el motor de transporte de carga prototípico¹⁸.

Las miosinas de clase 2, o las miosinas convencionales, incluyen las miosinas que potencian la contracción del músculo esquelético, cardíaco y liso, además de las isoformas no musculares de miosina 2 (NM2), NM2a, 2b y 2c^19. Las isoformas NM2 se encuentran en el citoplasma de todas las células y tienen funciones compartidas en citocinesis, adhesión, morfogénesis tisular y migración celular^19,20,21,22. Este artículo discute los protocolos convencionales de miosina en el contexto de la miosina no muscular 2b (NM2b)²³. NM2b, en comparación con M5a, tiene una relación de servicio baja y es enzimáticamente más lento con un_{V máximo} de 0.2 s^-123 en comparación con el V_max de M5a de ≈18 s^-124. En particular, las construcciones NM2b truncadas con dos cabezales no se mueven fácilmente procesivamente sobre la actina; más bien, cada encuentro con la actina resulta en un golpe de potencia seguido de la disociación de la molécula²⁵.

NM2b contiene dos cadenas pesadas de miosina, cada una con un dominio de cabeza globular, un brazo de palanca (con un ELC y una cadena ligera reguladora (RLC)), y un dominio de varilla / cola de bobina enrollada α-helicoidal, de aproximadamente 1.100 aminoácidos de largo, que dimeriza estas dos cadenas pesadas. La actividad enzimática y el estado estructural de NM2b están regulados por la fosforilación del RLC^23. NM2b no fosfoesforilado, en presencia de ATP y fuerzas iónicas fisiológicas (aproximadamente 150 mM de sal), adopta una conformación compacta en la que las dos cabezas hacen participar en una interacción asimétrica y la cola se pliega hacia atrás sobre las cabezas en dos lugares²³. En este estado, la miosina no interactúa fuertemente con la actina y tiene una actividad enzimática muy baja. Tras la fosforilación de RLC por la miosina quinasa de cadena ligera dependiente de calmodulina (MLCK) o la proteína quinasa asociada a Rho, la molécula se extiende y se asocia con otras miosinas a través de la región de la cola para formar filamentos bipolares de aproximadamente 30 moléculas de miosina²³. La fosforilación antes mencionada del RLC también conduce a un aumento de la actividad atPasa activada por actina de NM2b en aproximadamente cuatro veces^26,27,28. Esta disposición de filamento bipolar, con muchos motores de miosina en cada extremo, está optimizada para funciones en la contracción y el mantenimiento de la tensión, donde los filamentos de actina con polaridades opuestas se pueden mover entre sí^23,29. En consecuencia, se ha demostrado que NM2b actúa como un conjunto de motores cuando interactúa con la actina. El gran número de motores dentro de este filamento permite que los filamentos NM2b se muevan procesivamente sobre filamentos de actina, haciendo posible caracterizar la procesividad del filamento in vitro²⁹.

Si bien se ha avanzado en la comprensión del papel de las miosinas en la célula, existe la necesidad de comprender sus características individuales a nivel de proteínas. Para comprender las interacciones actomiosinas a un nivel simple de interacción proteína-proteína, en lugar de dentro de una célula, podemos expresar y purificar miosinas recombinantes para su uso en estudios in vitro. Los resultados de tales estudios informan a los mecanobiólogos sobre las propiedades biofísicas de las miosinas específicas que en última instancia impulsan procesos celulares complejos^12,13^,14,25,29. Por lo general, esto se logra agregando una etiqueta de afinidad a una construcción de miosina truncada o de longitud completa y purificando a través de cromatografía de afinidad^29,30,31. Además, la construcción puede ser diseñada para incluir un fluoróforo genéticamente encodable o una etiqueta para el etiquetado de proteínas con un fluoróforo sintético. Al agregar una etiqueta fluorescente de este tipo, se pueden realizar estudios de imágenes de moléculas individuales para observar la mecánica y la cinética de la miosina.

Después de la purificación, la miosina se puede caracterizar de varias maneras. La actividad de la ATPasa se puede medir mediante métodos colorimétricos, lo que proporciona información sobre el consumo total de energía y la afinidad de actina del motor en diferentes condiciones³². Para aprender sobre la mecanoquímica de su motilidad, se requieren más experimentos. Este documento detalla dos métodos basados en microscopía de fluorescencia in vitro que se pueden utilizar para caracterizar las propiedades móviles de una proteína de miosina purificada.

El primero de estos métodos es el ensayo de filamento de actina deslizante, que se puede utilizar para estudiar cuantitativamente las propiedades del conjunto de motores de miosina, así como para estudiar cualitativamente la calidad de un lote de proteína purificada³³. Aunque este artículo discute el uso de la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) para este ensayo, estos experimentos se pueden realizar de manera efectiva utilizando un microscopio de fluorescencia de campo amplio equipado con una cámara digital, que se encuentra comúnmente en muchos laboratorios³⁴. En este ensayo, una capa saturada de motores de miosina se une a una cubierta. Esto se puede lograr utilizando nitrocelulosa, anticuerpos, membranas, superficies derivadas de SiO₂(como trimetilorolosilano), entre otros^{29,33,35,36,37,38.} Los filamentos de actina etiquetados fluorescentemente se pasan a través de la cámara de la cubierta, sobre la cual la actina se une a la miosina unida a la superficie. Tras la adición de ATP (y quinasas en el estudio de NM2), la cámara se toma una imagen para observar la translocación de filamentos de actina por las miosinas unidas a la superficie. El software de seguimiento se puede utilizar para correlacionar la velocidad y la longitud de cada filamento de actina deslizante. El software de análisis también puede proporcionar una medida del número de filamentos de actina móviles y estacionarios, lo que puede ser útil para determinar la calidad de una preparación de miosina dada. La proporción de filamentos estancados también puede ser modulada intencionalmente por la unión superficial de la actina a otras proteínas y medida para determinar la dependencia de la carga de la miosina³⁹. Debido a que cada filamento de actina puede ser propulsado por un gran número de motores disponibles, este ensayo es muy reproducible, y la velocidad final medida es robusta a perturbaciones como alteraciones en la concentración de miosina inicial o la presencia de factores adicionales en la solución. Esto significa que se puede modificar fácilmente para estudiar la actividad de la miosina en diferentes condiciones, como la fosforilación alterada, la temperatura, la fuerza iónica, la viscosidad de la solución y los efectos de la carga inducida por las ataduras superficiales. Aunque factores como las “cabezas muertas” de miosina de unión fuerte incapaces de hidrólisis de ATP pueden causar filamentos de actina estancados, existen múltiples métodos para mitigar tales problemas y permitir mediciones precisas. Las propiedades cinéticas de la miosina varían mucho entre las clases y, dependiendo de la miosina específica utilizada, la velocidad del deslizamiento del filamento de actina en este ensayo puede variar desde menos de 20 nm / s (miosina^{9) 40,41}y hasta 60,000 nm / s (miosinacharaceana 11)⁴².

El segundo ensayo invierte la geometría del ensayo de filamento de actina deslizante¹². Aquí, los filamentos de actina se unen a la superficie de la cubierta y se visualiza el movimiento de moléculas individuales de M5a o de filamentos bipolares individuales de NM2b. Este ensayo se puede utilizar para cuantificar las longitudes y velocidades de ejecución de moléculas individuales de miosina o filamentos en la actina. Un coverslip está recubierto con un compuesto químico que bloquea la unión no específica y simultáneamente funcionaliza la superficie, como la biotina-polietilenglicol (biotina-PEG). La adición de derivados de avidina modificados luego prepara la superficie y la actina biotinilada pasa a través de la cámara, lo que resulta en una capa de F-actina unida de manera estable al fondo de la cámara. Finalmente, la miosina activada y etiquetada fluorescentemente (típicamente 1-100 nM) fluye a través de la cámara, que luego se toma una imagen para observar el movimiento de la miosina sobre los filamentos de actina estacionarios.

Estas modalidades representan métodos rápidos y reproducibles que se pueden emplear para examinar la dinámica de las miosinas no musculares y musculares. Este informe describe los procedimientos para purificar y caracterizar tanto M5a como NM2b, que representan miosinas no convencionales y convencionales, respectivamente. Esto es seguido por una discusión de algunas de las adaptaciones específicas de la miosina, que se pueden realizar para lograr una captura exitosa del movimiento en los dos tipos del ensayo.

Expresión y biología molecular
El ADNc para la miosina de interés debe clonarse en un vector pFastBac1 modificado que codifica para una etiqueta FLAG-terminal C (DYKDDDDK) si expresa M5a-HMM, o una etiqueta FLAG-terminal N si expresa la molécula de longitud completa de NM2b^{23,43,44,45,46}. Las etiquetas FLAG-terminales C en NM2b producen una afinidad debilitada de la proteína por la columna flag-afinidad. Por el contrario, la proteína marcada con FLAG N-terminal generalmente se une bien a la columna de afinidad FLAG²³. La proteína marcada N-terminalmente conserva la actividad enzimática, la actividad mecánica y la regulación dependiente de la fosforilación²³.

En este artículo, se utilizó una construcción truncada similar a la meromiosina pesada (HMM) del ratón M5a con un GFP entre la etiqueta FLAG y el extremo C de la cadena pesada de miosina. Tenga en cuenta que, a diferencia de NM2b, M5a-HMM se puede etiquetar y purificar con éxito con etiquetas FLAG de terminal N o C y, en ambos casos, la construcción resultante estará activa. La cadena pesada M5a se truncó en el aminoácido 1090 y contiene un enlazador de tres aminoácidos (GCG) entre el GFP y la región de bobina enrollada del M5a^47. No se agregó ningún vinculador adicional entre la GFP y la etiqueta FLAG. M5a-HMM se co-expresó con calmodulina. El constructo NM2b humano de longitud completa se co-expresó con ELC y RLC. El N-termini del RLC se fusionó con un GFP a través de un enlazador de cinco aminoácidos (SGLRS). Directamente adjunto a la etiqueta FLAG había un HaloTag. Entre el HaloTag y el N-terminal de la cadena pesada de miosina había un eslabón hecho de dos aminoácidos (AS).

Ambas preparaciones de miosina se purificaron a partir de un litro de cultivo celular Sf9 infectado con baculovirus a una densidad de aproximadamente 2 x 10⁶ células / ml. Los volúmenes del baculovirus para cada subunidad dependían de la multiplicidad de infección del virus según lo determinado por las instrucciones del fabricante. En el caso de M5a, las células fueron coinfectadas con dos baculovirus diferentes: uno para la calmodulina y otro para la cadena pesada M5a. En el caso del NM2b, las células fueron coinfectadas con tres virus diferentes: uno para ELC, uno para RLC y otro para la cadena pesada NM2b. Para los laboratorios que trabajan con una diversidad de miosinas (u otras proteínas multi complejas), este enfoque es eficiente ya que permite muchas combinaciones de cadenas pesadas y ligeras y las cadenas ligeras de uso común, como la calmodulina, pueden ser co-transfectadas con muchas cadenas pesadas de miosina diferentes. Todo el trabajo celular se completó en un gabinete de bioseguridad con la técnica estéril adecuada para evitar la contaminación.

Para la expresión de M5a y NM2b, las células Sf9 que producen las miosinas recombinantes se recolectaron 2-3 días después de la infección, mediante centrifugación, y se almacenaron a -80 ° C. Los gránulos celulares se obtuvieron centrifugando las células Sf9 coinfectadas a 4 °C durante 30 min a 2.800 x g. El proceso de purificación de proteínas se detalla a continuación.