Myosin-spezifische Anpassungen von In-vitro-Fluoreszenzmikroskopie-basierten Motilitätsassays

Myosine sind Motorproteine, die Kraft auf Aktinfilamente ausüben, indem sie die Energie aus der Adenosintriphosphat (ATP)-Hydrolyse^{nutzen 1}. Myosine enthalten eine Kopf-, Hals- und Schwanzdomäne. Die Kopfdomäne enthält die Aktinbindungsregion sowie den Ort der ATP-Bindung und Hydrolyse. Die Halsdomänen setzen sich aus IQ-Motiven zusammen, die an Leichte Ketten, Calmodulin oder Calmodulin-ähnliche Proteine^{binden 2,3}. Die Schwanzregion hat mehrere Funktionen, die für jede Klasse von Myosinen spezifisch sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Dimerisierung von zwei schweren Ketten, die Bindung von Frachtmolekülen und die Regulierung des Myosins durch autoinhibitorische Wechselwirkungen mit den Kopfdomänen¹.

Die beweglichen Eigenschaften von Myosin variieren stark zwischen den Klassen. Einige dieser Eigenschaften umfassen das Tastverhältnis (der Anteil des mechanischen Zyklus von Myosin, in dem das Myosin an Aktin gebunden ist) und die Prozessivität (die Fähigkeit eines Motors, vor dem Ablösen mehrere Schritte auf seiner Spur zu machen)⁴. Die über 40 Klassen von Myosinen wurden anhand von Sequenzanalysen^5,6,7,8bestimmt. Die Myosine der Klasse 2 werden als “konventionell” eingestuft, da sie die ersten waren, die untersucht wurden; alle anderen Klassen von Myosinen werden daher als “unkonventionell” eingestuft.

Myosin 5a (M5a) ist ein Myosin der Klasse 5 und ist ein prozessiver Motor, was bedeutet, dass es mehrere Schritte entlang des Aktins machen kann, bevor es sich dissoziiert. Es hat ein hohes Tastverhältnis, was darauf hindeutet, dass es einen großen Teil seines mechanischen Zyklus an Aktin^9,10,11,^12,13,14gebunden ist . Wie andere Myosine enthält die schwere Kette eine N-terminale Motordomäne, die sowohl eine Aktinbindungs- als auch eine ATP-Hydrolysestelle umfasst, gefolgt von einer Halsregion, die als Hebelarm dient, mit sechs IQ-Motiven, die an essentielle Leichtketten (ELC) und Calmodulin (CaM)^{binden 15}. Der Schwanzbereich enthält α-spiralförmige Coils, die das Molekül dimerisieren, gefolgt von einem kugelförmigen Schwanzbereich zur Bindung von Fracht. Seine Kinetik spiegelt seine Beteiligung am Transport von Melanosomen in Melanozyten und des endoplasmatischen Retikulums in Purkinje-Neuronen^16,17wider. M5a gilt als prototypischer Gütertransportmotor^18.

Klasse-2-Myosine oder die herkömmlichen Myosine umfassen die Myosine, die die Kontraktion der Skelett-, Herz- und glatten Muskulatur zusätzlich zu den nichtmuskleären Myosin-2 (NM2)-Isoformen NM2a, 2b und 2c¹⁹antreiben. Die NM2-Isoformen befinden sich im Zytoplasma aller Zellen und haben eine gemeinsame Rolle bei der Zytokinese, Adhäsion, Gewebemorphogenese und Zellmigration^19,20,21,22. Dieser Artikel diskutiert konventionelle Myosinprotokolle im Kontext von nichtmuskleellem Myosin 2b (NM2b)²³. NM2b hat im Vergleich zu M5a ein niedriges Tastverhältnis und ist enzymatisch langsamer mit einem V_max von 0,2 s^-123 im Vergleich zu M5as V_max von ≈18 s^-124. Bemerkenswerterweise bewegen sich abgeschnittene NM2b-Konstrukte mit zwei Köpfen nicht ohne weiteres prozessiv auf Aktin; Vielmehr führt jede Begegnung mit Aktin zu einem Kraftschlag, gefolgt von einer Dissoziation des^{Moleküls 25.}

NM2b enthält zwei myosinschwere Ketten mit jeweils einer kugelförmigen Kopfdomäne, einem Hebelarm (mit einer ELC und einer regulatorischen Leichtkette (RLC)) und einer α-helikalen Coiled-Coil-Rod/Tail-Domäne, etwa 1.100 Aminosäuren lang, die diese beiden schweren Ketten dimerisiert. Die enzymatische Aktivität und der Strukturzustand von NM2b werden durch Phosphorylierung des RLC²³reguliert. Unphosphoryliertes NM2b nimmt in Gegenwart von ATP und physiologischen Ionenstärken (ca. 150 mM Salz) eine kompakte Konformation an, bei der die beiden Köpfe an einer asymmetrischen Wechselwirkung teilnehmen und der Schwanz an zwei Stellen²³über die Köpfe zurückklappt. In diesem Zustand interagiert das Myosin nicht stark mit Aktin und hat eine sehr geringe enzymatische Aktivität. Bei RLC-Phosphorylierung durch Calmodulin-abhängige Myosin-Leichtkettenkinase (MLCK) oder Rho-assoziierte Proteinkinase dehnt sich das Molekül aus und assoziiert sich mit anderen Myosinen durch den Schwanzbereich, um bipolare Filamente von etwa 30 Myosinmolekülen zu bilden²³. Die vorgenannte Phosphorylierung des RLC führt auch zu einer erhöhten Aktin-aktivierten ATPase-Aktivität von NM2b um etwa das Vierfache^26,27,28. Diese bipolare Filamentanordnung mit vielen Myosinmotoren an jedem Ende ist für Rollen bei der Kontraktions- und Spannungserhaltung optimiert, bei denen Aktinfilamente mit entgegengesetzten Polaritäten relativ zueinander bewegt werden können^23,29. Dementsprechend hat sich gezeigt, dass NM2b als Einzensemble von Motoren fungiert, wenn es mit Aktin interagiert. Die große Anzahl von Motoren in diesem Filament ermöglicht es NM2b-Filamenten, sich prozessiv auf Aktinfilamenten zu bewegen, wodurch die Prozessivität des In-vitro-Filaments charakterisiert werden^{kann 29}.

Während Fortschritte beim Verständnis der Rolle von Myosinen in der Zelle erzielt wurden, besteht die Notwendigkeit, ihre individuellen Eigenschaften auf Proteinebene zu verstehen. Um Actomyosin-Interaktionen auf einer einfachen Protein-Protein-Interaktionsebene und nicht innerhalb einer Zelle zu verstehen, können wir rekombinante Myosine für die Verwendung in In-vitro-Studien exprimieren und reinigen. Die Ergebnisse solcher Studien informieren Mechanoobiologen dann über die biophysikalischen Eigenschaften spezifischer Myosine, die letztendlich komplexe zelluläre Prozesse antreiben^{12,13,14,25,29}. Typischerweise wird dies erreicht, indem einem Myosinkonstrukt in voller Länge oder einem abgeschnittenen Myosinkonstrukt ein Affinitäts-Tag hinzugefügt und mittels Affinitätschromatographie^29,30,31aufgereinigt wird. Darüber hinaus kann das Konstrukt so konstruiert werden, dass es ein genetisch kodierbares Fluorophor oder ein Tag für die Proteinmarkierung mit einem synthetischen Fluorophor enthält. Durch Hinzufügen einer solchen fluoreszierenden Markierung können Einzelmolekül-Bildgebungsstudien durchgeführt werden, um die Myosinmechanik und -kinetik zu beobachten.

Nach der Reinigung kann das Myosin auf verschiedene Arten charakterisiert werden. Die ATPase-Aktivität kann mit kolorimetrischen Methoden gemessen werden, die Einenschluss über den Gesamtenergieverbrauch und die Aktinaffinität des Motors unter verschiedenen Bedingungen geben³². Um mehr über die Mechanochemie seiner Motilität zu erfahren, sind weitere Experimente erforderlich. Dieser Artikel beschreibt zwei auf In-vitro-Fluoreszenzmikroskopie basierende Methoden, mit denen die beweglichen Eigenschaften eines gereinigten Myosinproteins charakterisiert werden können.

Die erste dieser Methoden ist der Gleit-Aktin-Filament-Assay, mit dem die Ensembleeigenschaften von Myosinmotoren quantitativ untersucht und die Qualität einer Charge gereinigten Proteins qualitativ untersucht werden können³³. Obwohl in diesem Artikel die Verwendung der TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence) für diesen Assay diskutiert wird, können diese Experimente effektiv mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop durchgeführt werden, das mit einer Digitalkamera ausgestattet ist, die häufig in vielen Labors zu finden^{ist 34}. Bei diesem Assay wird eine sättigende Schicht von Myosinmotoren an einem Deckslip befestigt. Dies kann mit Nitrocellulose, Antikörpern, Membranen, SiO2-derivatisierten Oberflächen (wie Trimethylchlorsilan), unter anderem²⁹, 33^,35,36,37,38erreicht werden. Fluoreszierend markierte Aktinfilamente werden durch die Decklippenkammer geleitet, auf der das Aktin an das an der Oberfläche befestigte Myosin bindet. Nach Zugabe von ATP (und Kinasen in der Untersuchung von NM2) wird die Kammer abgebildet, um die Translokation von Aktinfilamenten durch die oberflächengebundenen Myosine zu beobachten. Tracking-Software kann verwendet werden, um die Geschwindigkeit und Länge jedes gleitenden Aktinfilaments zu korrelieren. Analysesoftware kann auch ein Maß für die Anzahl der beweglichen und stationären Aktinfilamente liefern, was nützlich sein kann, um die Qualität eines bestimmten Myosinpräparats zu bestimmen. Der Anteil an festgefahrenen Filamenten kann auch absichtlich durch Oberflächenanbindeung von Aktin an andere Proteine moduliert und gemessen werden, um die Lastabhängigkeit des Myosins zu bestimmen^39. Da jedes Aktinfilament von einer großen Anzahl verfügbarer Motoren angetrieben werden kann, ist dieser Assay sehr reproduzierbar, wobei die endgültige gemessene Geschwindigkeit robust gegenüber Störungen wie Veränderungen der Anfangsmyosinkonzentration oder dem Vorhandensein zusätzlicher Faktoren in der Lösung ist. Dies bedeutet, dass es leicht modifiziert werden kann, um die Myosinaktivität unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen, wie z. B. veränderte Phosphorylierung, Temperatur, Ionenstärke, Lösungsviskosität und die Auswirkungen der durch Oberflächengurte induzierten Belastung. Obwohl Faktoren wie stark bindende Myosin-“Totköpfe”, die nicht in der Lage sind, ATP-Hydrolyse zu blockierenden Aktinfilamenten führen können, gibt es mehrere Methoden, um solche Probleme zu mildern und genaue Messungen zu ermöglichen. Die kinetischen Eigenschaften von Myosin variieren stark zwischen den Klassen und abhängig vom verwendeten spezifischen Myosin kann die Geschwindigkeit des Aktinfilamentgleitens in diesem Assay von unter 20 nm / s (Myosin 9)^40,41und bis zu 60.000 nm / s (Characean Myosin 11)⁴²variieren .

Der zweite Assay invertiert die Geometrie des gleitenden Aktinfilament-Assays¹². Hierbei werden die Aktinfilamente an die Deckschichtoberfläche gebunden und die Bewegung einzelner Moleküle von M5a oder einzelner bipolarer Filamente von NM2b visualisiert. Dieser Assay kann verwendet werden, um die Lauflängen und Geschwindigkeiten einzelner Myosinmoleküle oder Filamente auf Aktin zu quantifizieren. Ein Deckrutsch ist mit einer chemischen Verbindung beschichtet, die unspezifische Bindungen blockiert und gleichzeitig die Oberfläche funktionalisiert, wie z.B. Biotin-Polyethylenglykol (Biotin-PEG). Die Zugabe von modifizierten Avidinderivaten primet dann die Oberfläche und biotinyliertes Aktin wird durch die Kammer geleitet, was zu einer Schicht F-Aktin führt, die stabil an den Boden der Kammer gebunden ist. Schließlich wird aktiviertes und fluoreszierend markiertes Myosin (typischerweise 1-100 nM) durch die Kammer geflossen, das dann abgebildet wird, um die Myosinbewegung über die stationären Aktinfilamente zu beobachten.

Diese Modalitäten stellen schnelle und reproduzierbare Methoden dar, mit denen die Dynamik sowohl von nichtmuskleären als auch von Muskelmoosinen untersucht werden kann. Dieser Bericht beschreibt die Verfahren zur Reinigung und Charakterisierung von M5a und NM2b, die unkonventionelle bzw. konventionelle Myosine darstellen. Es folgt eine Diskussion einiger myosinspezifischer Anpassungen, die durchgeführt werden können, um eine erfolgreiche Bewegungserfassung in den beiden Arten des Assays zu erreichen.

Expression und Molekularbiologie
Die cDNA für das interessierende Myosin muss auf einen modifizierten pFastBac1-Vektor geklont werden, der entweder für ein C-terminales FLAG-Tag (DYKDDDDK) kodiert, wenn M5a-HMM exprimiert wird, oder für ein N-terminales FLAG-Tag, wenn es das Molekül in voller Länge von NM2b^{23,43,44,45,46}exprimiert. C-terminale FLAG-Tags auf NM2b führen zu einer geschwächten Affinität des Proteins für die FLAG-Affinitätssäule. Im Gegensatz dazu bindet das N-terminale FLAG-markierte Protein normalerweise gut an die FLAG-Affinitätssäule²³. Das N-terminal markierte Protein behält enzymatische Aktivität, mechanische Aktivität und phosphorylierungsabhängige Regulation²³bei.

In dieser Arbeit wurde ein abgeschnittenes Maus-M5a-schweres Meromyosin (HMM)-ähnliches Konstrukt mit einem GFP zwischen dem FLAG-Tag und dem C-Terminus der schweren Myosinkette verwendet. Beachten Sie, dass M5a-HMM im Gegensatz zu NM2b erfolgreich mit N- oder C-Terminal FLAG-Tags markiert und gereinigt werden kann und in beiden Fällen das resultierende Konstrukt aktiv ist. Die M5a-Schwerkette wurde an der Aminosäure 1090 abgeschnitten und enthält einen Drei-Aminosäure-Linker (GCG) zwischen dem GFP und dem Coiled-Coil-Bereich des M5a^47. Zwischen GFP und FLAG-Tag wurde kein zusätzlicher Linker hinzugefügt. M5a-HMM wurde zusammen mit Calmodulin exprimiert. Das menschliche NM2b-Konstrukt in voller Länge wurde zusammen mit ELC und RLC exprimiert. Die N-Termini des RLC wurden über einen Linker aus fünf Aminosäuren (SGLRS) mit einem GFP verschmolzen. Direkt am FLAG-Tag war ein HaloTag angebracht. Zwischen dem HaloTag und dem N-Terminus der Myosin-Schwerkette befand sich ein Linker aus zwei Aminosäuren (AS).

Beide Myosinpräparate wurden aus einem Liter sf9-Zellkultur, die mit Baculovirus infiziert war, mit einer Dichte von etwa 2 x 10⁶ Zellen/ml gereinigt. Die Volumina des Baculovirus für jede Untereinheit hingen von der Vielzahl der Infektionen des Virus ab, die durch die Anweisungen des Herstellers bestimmt wurde. Im Fall von M5a wurden die Zellen mit zwei verschiedenen Baculoviren koinfiziert – eines für Calmodulin und eines für M5a schwere Kette. Im Fall des NM2b wurden die Zellen mit drei verschiedenen Viren koinfiziert – eines für ELC, eines für RLC und eines für NM2b Schwere Kette. Für Labore, die mit einer Vielzahl von Myosinen (oder anderen multikomplexen Proteinen) arbeiten, ist dieser Ansatz effizient, da er viele Kombinationen von schweren und leichten Ketten ermöglicht und häufig verwendete leichte Ketten wie Calmodulin mit vielen verschiedenen schweren Myosinketten kotransfiziert werden können. Alle Zellarbeiten wurden in einer Biosicherheitswerkbank mit geeigneter steriler Technik durchgeführt, um eine Kontamination zu vermeiden.

Für die Expression von M5a und NM2b wurden die Sf9-Zellen, die die rekombinanten Myosine produzieren, 2-3 Tage nach der Infektion durch Zentrifugation gesammelt und bei -80 °C gelagert. Zellpellets wurden durch Zentrifugieren der koinfizierten Sf9-Zellen bei 4 °C für 30 min bei 2.800 x gerhalten. Der Proteinreinigungsprozess wird im Folgenden detailliert beschrieben.