מוצג כאן הליך לבטא ולטהר מיוסין 5a ואחריו דיון על אפיון שלה, באמצעות הרכב ומולקולה אחת במבחנה מיקרואורסצנטיות מבוססות בדיקות, וכיצד שיטות אלה ניתן לשנות עבור אפיון של מיוסין nonmuscle 2b.
חלבוני מיוסין לאגד אינטראקציה עם אקטין חוטי (F-actin) ונמצאים אורגניזמים על פני העץ phylogenetic. המבנה שלהם ואת המאפיינים אנזימטיים מותאמים לתפקוד מסוים שהם מבצעים בתאים. מיוסין 5a הולך תהליכית על F-actin כדי להעביר מלנוזומים ושלשלות בתאים. לעומת זאת, מיוסין 2b לא-מולקולרי פועל כחם דו קוטבי המכיל כ-30 מולקולות. הוא מזיז F-actin של קוטביות הפוכה לכיוון מרכז חוט, שבו מולקולות המיוסין פועלות באופן אסינכרוני כדי לקשור actin, להקנות שבץ כוח, ולנתק לפני חוזר על המחזור. מיוסין לא-נוסוס 2b, יחד עם המיוסין 2 איזופורמים אחרים שלה, יש תפקידים הכוללים הידבקות תא, ציטוקינזיס, ותחזוקת מתח. המכנוכימיה של מיוסין ניתן ללמוד על ידי ביצוע במבחנה תנועתיות ישבן באמצעות חלבונים מטוהרים. בפעולת ההזזה, המיוסין קשורים למשטח מיקרוסקופ המכסה את פני השטח ואת הפלואורסצנטיות שכותרתו F-actin, אשר ניתן לעקוב. עם זאת, במולקולה/אנסמבל התנועתיות, נצפתה F-actin קשורה לכיסוי ותנועה של מולקולות מיוסין שכותרתן פלואורסצנטית על F-actin נצפתה. בדו”ח זה, טיהור של מיוסין רקומביננטי 5a מתאי Sf9 באמצעות כרומטוגרפיה זיקה הוא מתואר. לאחר מכן, אנו מתארים שתי בדיקות מבוססות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית: בדיקת חוטי אקטן הזזה ובוחן תנועתיות הפוכה. מבדים אלה, ניתן לחלץ פרמטרים כגון מהירויות טרנסלוקציה actin ואורכי ריצה של מולקולה אחת ומהירויות באמצעות תוכנת ניתוח התמונה. טכניקות אלה ניתן ליישם גם כדי ללמוד את התנועה של חוטים בודדים של מיוסין לאmuscle 2 איזופורמים, נדון כאן בהקשר של מיוסין לאmuscle 2b. זרימת עבודה זו מייצגת פרוטוקול וסדרת כלים כמותיים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את דינמיקת המולקולה וההרכב הבודדת של מיוסין לא-מולקולריים.
מיוסינוס הם חלבונים מוטוריים המפעילים כוח על חוטי אקטין באמצעות האנרגיה המופקת מאדנוסין טריפוספט (ATP) הידרוליזה1. מיוסין מכילים תחום ראש, צוואר וזנב. התחום הראשי מכיל את אזור איגוד actin, כמו גם את האתר של כריכת ATP הידרוליזה. תחומי הצוואר מורכבים מוטיבים IQ, אשר נקשרים שרשראות אור, calmodulin, או חלבונים דמויי calmodulin2,3. לאזור הזנב יש מספר פונקציות ספציפיות לכל סוג של מיוסין, כולל אך לא רק עמעום של שתי שרשראות כבדות, כריכה של מולקולות מטען, ורגולציה של המיוסין באמצעות אינטראקציות autoinhibitory עם תחומי הראש1.
המאפיינים הרוטאליים של מיוסין משתנים מאוד בין השיעורים. חלק ממאפיינים אלה כוללים יחס חובה (השבר של המחזור המכני של מיוסין שבו myosin מחויב לפעול) ועיבוד (היכולת של מנוע לעשות צעדים מרובים על המסלול שלה לפני ניתוק)4. מעל 40 הכיתות של מיוסין נקבעו על סמך ניתוחירצף 5,6,7,8. מיוסין בכיתה 2 מסווגים “קונבנציונאלי” מאז הם היו הראשונים ללמוד; כל המעמדות האחרים של המיוסין מסווגים, אם כן, כ”לא שגרתיים”.
מיוסין 5a (M5a) הוא מיוסין בכיתה 5 והוא מנוע תהליכי, כלומר הוא יכול לקחת צעדים מרובים לאורך actin לפני ניתוק. יש לו יחס חובה גבוה, המציין כי הוא מבלה חלק גדול מהמחזור המכני שלו מחויב לפעול9,10,11,12,13,14. במשותף עם מיוזינים אחרים, השרשרת הכבדה מכילה תחום מנוע N-terminal הכולל הן אקטין מחייב ואתר הידרוליזה ATP ואחריו אזור צוואר המשמש זרוע ידית, עם שישה מוטיבים IQ להיקשר שרשראות אור חיוניות (ELC) ו calmodulin (CaM)15. אזור הזנב מכיל סלילים מסלילים α-סליליים סליליים, אשר עמעמים את המולקולה, ואחריו אזור זנב כדורי למטען מחייב. הקינטיקה שלה משקפת את מעורבותה בהובלת מלנוזומים במלנוציטים ובריטיקולום אנדופלסמי בנוירונים פורקיניה16,17. M5a נחשב מנוע הובלת מטענים טיפוסי18.
מיוזינים מסוג 2, או מיוזינים קונבנציונליים, כוללים את המאוזינים המעצימים התכווצות של שלד, לב ושריר חלק בנוסף לאיזוסין לא-מומסקל 2 (NM2) איזופורמים, NM2a, 2b ו- 2c19. איזופורמים NM2 נמצאים ציטופלסמה של כל התאים ויש להם תפקידים משותפים ציטוקינזה, הידבקות, מורפוגנזה רקמות, ונדידת תאים19,20,21,22. מאמר זה דן פרוטוקולי מיוסין קונבנציונליים בהקשר של מיוסין לא 1000 (NM2b)23. NM2b, בהשוואה ל- M5a, יש יחס חובה נמוך והוא איטי יותר אנזימטית עםV מקסימום של 0.2 s-123 לעומתV max של M5a של ≈18 s-124. ראוי לציין, מבנים NM2b חתוכים עם שני ראשים אינם נעים בקלות על actin; במקום זאת, כל מפגש עם actin תוצאות שבץ כוח ואחריו דיסוציאציה של המולקולה25.
NM2b מכיל שתי שרשראות כבדות מיוסין, כל אחת עם דומיין ראש כדורי אחד, זרוע ידית אחת (עם ELC אחד ושרשרת אור רגולטורית אחת (RLC)), וגזע מוט סליל סליל / זנב סליל α סלילי, באורך של כ -1,100 חומצות אמינו, המבליט את שתי השרשראות הכבדות הללו. הפעילות אנזימטית ומצב מבני של NM2b מוסדרים על ידי זרחן של RLC23. NM2b לא מפוזר, בנוכחות ATP וכוחות יוניים פיזיולוגיים (כ 150 מ”מ מלח), מאמץ קונפורמציה קומפקטית שבה שני הראשים להשתתף באינטראקציה אסימטרית והזנב מתקפל בחזרה מעל הראשים בשני מקומות23. במצב זה, myosin אינו אינטראקציה חזקה עם actin ויש לו פעילות אנזימטית נמוכה מאוד. על זרחן RLC על ידי קטיעת שרשרת אור מיוסין תלוי מיוסין (MLCK) או קינאז חלבון הקשורים לרו, המולקולה משתרעת ומתחברת למיוזינים אחרים דרך אזור הזנב כדי ליצור חוטים דו קוטביים של כ -30 מולקולות מיוסין23. הזרחן הנ”ל של RLC מוביל גם לפעילות ATPase מוגברת המופעלת על ידי actin של NM2b על ידי כארבע פעמים26,27,28. סידור חוט דו קוטבי זה, הכולל מנועי מיוסין רבים בכל קצה, מותאם לתפקידים בתחזוקת התכווצות ומתח, שם ניתן להזיז חוטי אקטין עם קוטביות מנוגדת ביחס זה לזה23,29. בהתאם, NM2b הוכח לפעול כהרכב של מנועים בעת אינטראקציה עם actin. המספר הגדול של מנועים בתוך חוט זה מאפשרים חוטי NM2b לנוע באופן תהליכי על חוטי actin, מה שהופך את עיבוד חוטי הפריה ישון אפשרי לאפיין29.
בעוד התקדמות נעשתה בהבנת התפקיד של מיוסין בתא, יש צורך להבין את המאפיינים האישיים שלהם ברמת החלבון. כדי להבין אינטראקציות actomyosin ברמת אינטראקציה חלבון-חלבון פשוט, ולא בתוך תא, אנו יכולים לבטא ולטהר מיוסין רקומביננטי לשימוש במחקרים במבחנה. התוצאות של מחקרים כאלה אז ליידע mechanobiologists על המאפיינים הביופיסיים של מיוסין ספציפי כי בסופו של דבר לנהוג תהליכים תאיים מורכבים12,13,14,25,29. בדרך כלל, זה מושג על ידי הוספת תג זיקה למבנה מיוסין באורך מלא או חתוך וטיהור באמצעות כרומטוגרפיהזיקה 29,30,31. בנוסף, ניתן להנדס את המבנה כך שיכלול פלואורופור שניתן להקפיץ גנטית או תג לתיוג חלבונים עם פלואורופור סינתטי. על ידי הוספת תווית פלואורסצנטית כזו, ניתן לבצע מחקרי הדמיה של מולקולה אחת כדי להתבונן במכניקת מיוסין וקינטיקה.
לאחר הטיהור, המיוסין יכול להיות מאופיין במספר דרכים. פעילות ATPase יכולה להימדד בשיטות צבעוניות, המספקות תובנה לגבי צריכת האנרגיה הכוללת וזיקה לפעולה של המנוע בתנאים שונים32. כדי ללמוד על המכנוכימיה של תנועתיותה, נדרשים ניסויים נוספים. מאמר זה מפרט שתי שיטות מבוססות מיקרוסקופיה במבחנה, שניתן להשתמש בהן כדי לאפיין את המאפיינים הססנים של חלבון מיוסין מטוהר.
הראשון של שיטות אלה הוא בדיקת חוט אקטן הזזה, אשר ניתן להשתמש בו כדי ללמוד כמותית את תכונות ההרכב של מנועי מיוסין, כמו גם ללמוד באופן איכותי את האיכות של אצווה של חלבון מטוהר33. למרות מאמר זה דן בשימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF) לבדיקה זו, ניסויים אלה יכולים להתבצע ביעילות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה המצויד במצלמה דיגיטלית, שנמצאת בדרך כלל במעבדות רבות34. בבחינה זו, שכבה רוויה של מנועי מיוסין מחוברת לכיסוי. זה יכול להתבצע באמצעות ניטרוצלולוז, נוגדנים, ממברנות, SiO2– משטחים נגזרים (כגון trimethylchlorosilane), בין היתר29,33,35,36,37,38. חוטי אקטין המסומנים בפלואורסצנטית מועברים דרך תא כיסויי השער, שעליו האקטין נקשר למיוסיפן המחובר לפני השטח. עם תוספת של ATP (וקינאזים בחקר NM2), התא הוא התמונה כדי לצפות טרנסלוקציה של חוטי actin על ידי מיוזינים כבול פני השטח. תוכנת מעקב יכולה לשמש כדי לתאם את המהירות והאורך של כל חוט אקטאין הזזה. תוכנת ניתוח יכולה גם לספק מידה של מספר חוטי actin נעים ונייחים, אשר יכול להיות שימושי כדי לקבוע את האיכות של הכנת מיוסין נתון. חלקם של חוטים תקועים יכול גם להיות מווסת בכוונה על ידי קשירת פני השטח של actin חלבונים אחרים ונמדד כדי לקבוע את התלות בעומס של מיוסין39. מכיוון שכל חוט אקטין יכול להיות מונע על ידי מספר רב של מנועים זמינים, בדיקה זו ניתנת לשחזור רב, כאשר המהירות הנמדדת הסופית חזקה להסתבכויות כגון שינויים בריכוז המיוסין ההתחלתי או נוכחות של גורמים נוספים בפתרון. משמעות הדבר היא שניתן לשנות אותו בקלות כדי ללמוד פעילות מיוסין בתנאים שונים, כגון זרחן שונה, טמפרטורה, כוח יוני, צמיגות פתרון, ואת ההשפעות של עומס המושרה על ידי צמיגי פני השטח. למרות גורמים כגון מיוסין חזק מחייב “ראשים מתים” מסוגל הידרוליזה ATP יכול לגרום חוטי actin תקוע, שיטות מרובות קיימות כדי למתן בעיות כאלה ולאפשר מדידות מדויקות. המאפיינים הקינטיים של מיוסין משתנים מאוד בין הכיתות, ובהתאם למיוסין הספציפי המשמש, מהירות גלישת חוטי האקטין בבדיקה זו יכולה להשתנות מתחת ל-20 ננומטר/שניה (מיוסין 9)40,41,ועד 60,000 ננומטר/שניה(Characean myosin 11)42.
הבחינה השנייה הפוך את הגיאומטריה של חוט ההזזה12. כאן, חוטי actin מחוברים משטח כיסוי ואת התנועה של מולקולות בודדות של M5a או של חוטים דו קוטביים בודדים של NM2b הם חזותיים. בדיקה זו יכולה לשמש כדי לכמת את אורכי הריצה והמהירויות של מולקולות מיוסין יחיד או חוטים על actin. כיסוי מצופה בתרכובת כימית שחוסמת כריכה לא ספציפית ובמקביל מתפקדת את פני השטח, כגון ביוטין-פוליאתילן גליקול (ביוטין-PEG). התוספת של נגזרות אבידין מותאמות לאחר מכן ראשוניים את פני השטח ו actin biotinylated מועבר דרך התא, וכתוצאה מכך שכבה של F-actin קשור ביציבות לתחתית התא. לבסוף, מופעל ופלואורסצנטית שכותרתו מיוסין (בדרך כלל 1-100 ננומטר) זורם דרך התא, אשר לאחר מכן הוא התמונה להתבונן תנועת מיוסין מעל חוטי actin נייח.
שיטות אלה מייצגות שיטות מהירות וניתן לשחזור שניתן להשתמש בהן כדי לבחון את הדינמיקה של מיוסין לא-נואזמי ושרירים כאחד. דו”ח זה מתאר את הנהלים לטהר ולאפיין הן M5a והן NM2b, המייצגים מיוסין לא קונבנציונאלי וקונבנציונלי, בהתאמה. לאחר מכן דיון על כמה עיבודים ספציפיים myosin, אשר ניתן לבצע כדי להשיג לכידה מוצלחת של תנועה בשני סוגי הבחינה.
ביטוי וביולוגיה מולקולרית
יש לשכפל את ה- cDNA עבור המיוסין של העניין בווקטור pFastBac1 שונה המקודד עבור תג דגל מסוף C (DYKDDDDDK) אם הוא מבטא M5a-HMM, או תג דגל N-terminal אם הוא מבטא את המולקולה באורך מלא של NM2b23,43,44,45,46. תגי דגל מסוף C ב- NM2b גורמים לזיקה מוחלשת של החלבון לעמודת זיקת הדגל. לעומת זאת, החלבון המתויג על ידי דגל N בדרך כלל נקשר היטב לעמודת זיקת הדגל23. החלבון המתויג ב- N-סופני שומר על פעילות אנזימטית, פעילות מכנית ותקנה תלוית זרחן23.
במאמר זה, עכבר קטוע M5a כבד meromyosin (הממ) כמו מבנה עם GFP בין תג דגל ואת C-terminus של שרשרת כבד מיוסין שימש. שים לב שבניגוד ל- NM2b, ניתן לתייג ולטהר בהצלחה את M5a-HMM באמצעות תגי דגל N או C-terminal ובשני המקרים המבנה המתקבל יהיה פעיל. השרשרת הכבדה M5a נחתכה בחומצת אמינו 1090 ומכילה מקשר שלוש חומצות אמינו (GCG) בין GFP לאזור הסליל המפותל של M5a47. לא נוסף מקשר נוסף בין ה- GFP לתג FLAG. M5a-HMM בא לידי ביטוי בקלמודולין. מבנה NM2b האנושי באורך מלא בא לידי ביטוי בשיתוף עם ELC ו- RLC. N-termini של RLC הותך עם GFP באמצעות מקשר של חמש חומצות אמינו (SGLRS). מצורף ישירות לתג הדגל היה HaloTag. בין HaloTag ואת N-טרמינל של שרשרת כבד מיוסין היה מקשר עשוי שתי חומצות אמינו (AS).
שתי תכשירי המיוסין טוהרו מליטר אחד של תרבית תאי Sf9 נגועים בבקולווירוס בצפיפות של כ 2 x 106 תאים / מ”ל. נפחי הבאקולווירוס עבור כל תת-ארון היו תלויים בריבוי הזיהום של הנגיף כפי שנקבע בהוראות היצרן. במקרה של M5a, תאים נדבקו במשותף עם שני baculoviruses שונים – אחד עבור calmodulin, ואחד עבור שרשרת כבדה M5a. במקרה של NM2b, תאים נדבקו במשותף עם שלושה וירוסים שונים – אחד עבור ELC, אחד עבור RLC, ואחד עבור שרשרת כבדה NM2b. עבור מעבדות העובדות עם מגוון של מיוסין (או חלבונים רב-קומתיים אחרים), גישה זו יעילה שכן היא מאפשרת שילובים רבים של שרשראות כבדות וקלות ושרשראות אור נפוצות כגון calmodulin ניתן לבצע שיתוף פעולה עם שרשראות כבדות מיוסין רבות ושונות. כל עבודת התא הושלמה בארון בטיחות ביולוגית עם טכניקה סטרילית נכונה כדי למנוע זיהום.
עבור הביטוי של M5a ו- NM2b, תאי Sf9 המייצרים את המיוסינוסים רקומביננטיים נאספו 2-3 ימים לאחר ההדבקה, באמצעות צנטריפוגה, ואוחסנו ב -80 °C (80 °F). כדורי תאים הושגו על ידי צנטריפוגה של תאי Sf9 נגועים במשותף ב 4 °C (50 °F) במשך 30 דקות ב 2,800 x g. תהליך טיהור החלבון מפורט להלן.
מוצג כאן הוא זרימת עבודה עבור טיהור ואפיון במבחנה של מיוסין 5a ומיוסין לא 100b. קבוצה זו של ניסויים שימושית לכימות התכונות המכנוכימיות של מבנים מיוסין מטוהרים באופן מהיר ושחזורי. למרות שני המיוסין המוצגים כאן הם רק שתי דוגמאות ספציפיות מתוך האפשרויות הרבות, ניתן ליישם את התנאים והטכניקות, עם…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לד”ר פאנג ג’אנג על הסיוע הטכני בהכנת ריאגנטים המשמשים לאיסוף נתונים אלה. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר התוך-רחמית NHLBI/NIH מממנת את HL001786 ל- J.R.S.
1 mL Syringe | BD | 309628 | |
2 M CaCl2 Solution | VWR | 10128-558 | |
2 M MgCl2 Solution | VWR | 10128-298 | |
27 Gauge Needle | Becton Dickinson | 309623 | |
5 M NaCl Solution | KD Medical | RGE-3270 | |
Acetic Acid | ThermoFisher Scientific | 984303 | |
Amyl Acetate | Ladd Research Industries | 10825 | |
Anti-FLAG M2 Affinity Gel | Millipore Sigma | A2220 | https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf |
ATP | Millipore Sigma | A7699 | |
Biotinylated G-Actin | Cytoskeleton, Inc. | AB07 | |
Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | 5470 | |
bPEG-silane | Laysan Bio, Inc | Biotin-PEG-SIL-3400-1g | |
Bradford Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | |
Calmodulin | PMID: 2985564 | ||
Catalase | Millipore Sigma | C40 | |
Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 11496015 | http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf |
Circular Filter Paper – Gliding Assay | Millipore Sigma | WHA1001125 | |
Circular Filter Paper – Inverted Assay | Millipore Sigma | WHA1001090 | |
cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor Tablets | Millipore Sigma | 5056489001 | This should be stored at 4 °C. The tablets can be used directly or can be reconstituted as a 25x stock solution by dissolving 1 tablet in 2 mL of distilled water. The resulting solution can be stored at 4 °C for 1-2 weeks or at least 12 weeks at -20 °C. |
Concentrating Tubes (100,000 MWCO) | EMD Millipore Corporation | UFC910024 | The MWCO of the tube is not necessarily "one size fits all," as long as the MWCO is less than the total molecular weight of the protein being purified. The NM2b herein was concentrated with a 100,000 MWCO tube and the M5a was concentrated with a 30,000 MWCO tube. |
Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye | ThermoFisher Scientific | 20278 | |
Coverslip Rack | Millipore Sigma | Z688568-1EA | |
Coverslips: Gliding Acting Filament Assay | VWR International | 48366-227 | |
Coverslips: Inverted Motility Assay | Azer Scientific | ES0107052 | |
Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO) | Fischer Scientific | 08-670-5A | The diameter of the dialysis tube can vary, but the MWCO should be the same. The NM2b used herein was dialyzed in an 18 mm dialysis tube. The tubes can be stored in 20% alcohol solution at 4 °C. |
DL-Dithiothreitol | Millipore Sigma | D0632 | |
Double-Sided Tape | Office Depot | 909955 | |
DYKDDDDK Peptide | GenScript | RP10586 | This can be dissolved in a buffer containing 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3, and 10 mM MOPS (pH 7.2) to a final concentration of 50 mg/mL. This can be stored at -20 °C as 300 µL aliquots. |
EGTA | Millipore Sigma | E4378 | |
Elution Column | Bio-Rad | 761-1550 | These can be reused. To clean, rinse the column with 2-3 column volumes of PBS and distilled water. Chill the column at 4° C before use. |
Ethanol | Fischer Scientific | A4094 | |
G-actin | PMID: 4254541 | G-actin stock can be stored at 200 μM in liquid N2. | |
Glucose | Millipore Sigma | G8270 | |
Glucose Oxidase | Millipore Sigma | G2133 | |
Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L | Santa Cruz Biotechnology | sc-295018 | |
HaloTag | Promega | G100A | |
HCl | Millipore Sigma | 320331 | |
KCl | Fischer Scientific | P217-500 | |
Large-Orifice Pipet Tips | Fischer Scientific | 02-707-134 | |
Leupeptin Protease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 78435 | |
Mark12 Unstained Standard Ladder | ThermoFisher Scientific | LC5677 | |
Methanol | Millipore Sigma | MX0482 | |
Methylcellulose | Millipore Sigma | M0512 | |
Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-553-10 | |
MOPS | Fischer Scientific | BP308-100 | |
mPEG-silane | Laysan Bio, Inc | MPEG-SIL-2000-1g | |
Myosin Light Chain Kinase | PMID: 23148220 | FLAG-tagged MLCK can be purified the same way that the FLAG-tagged myosin was purified herein. | |
NaN3 | Millipore Sigma | S8032 | |
NeutrAvidin | ThermoFisher Scientific | 31050 | |
Nitrocellulose | Ladd Research Industries | 10800 | |
NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-well | ThermoFisher Scientific | NP0323PK2 | |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | |
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
PMSF | Millipore Sigma | 78830 | PMSF can be made as a 0.1 M stock solution in isopropanol and stored in 4 °C. Isopropanol addition results in crystal precipitation, which can be dissolved by stirring at room temperature. Immediately before use, PMSF can be added dropwise to a rapidly stirring solution to a final concentration of 0.1 mM. |
Razor Blades | Office Depot | 397492 | |
Rhodamine-Phalloidin | ThermoFisher Scientific | R415 | Stock can be diluted in 100% methanol to a final concentration of 200 μM. |
Sf9 Media | ThermoFisher Scientific | 12658-027 | This should be stored at 4° C. Its shelf life is 18 months from the date of manufacture. |
Tissue Culture Dish – Gliding Assay | Corning | 353025 | Each tissue culture dish can hold approximately nine coverslips. |
Tissue Culture Dish – Inverted Assay | Corning | 353003 | Each tissue culture dish can hold approximately four coverslips. |
Smooth-sided 200 µL Pipette Tips | Thomas Scientific | 1158U38 | |
EQUIPMENT | |||
Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75006590 | |
Microscope | Nikon | Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100x TIRF Objective (N.A. 1.49) | |
Microscope Camera | Andor | Model: iXon DU888 EMCCD camera (1024 x 1024 sensor format) | |
Microscope Environmental Control Box | Tokai HIT | Custom Thermobox | |
Microscope Laser Unit | Nikon | LU-n4 four laser unit with solid state lasers for 405nm, 488nm, 561nm,and 640nm | |
Mid Bench Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Model: CR3i | |
Misonix Sonicator | Misonix | XL2020 | |
Optima Max-Xp Tabletop Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
Plasma-Cleaner | Diener electronic GmbH + Co. KG | System Type: Zepto | |
Sonicator Probe (3.2 mm) | Qsonica | 4418 | |
Standard Incubator | Binder | Model: 56 | |
Waverly Tube Mixer | Waverly | TR6E | |
SOFTWARE | |||
ImageJ FIJI | https://imagej.net/Fiji/Downloads | ||
FAST (Version 1.01) | http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements | FAST is available for Mac OSX and Linux based systems. | |
Image Stabilizer Plugin | https://imagej.net/Image_Stabilizer | ||
ImageJ TrackMate | https://imagej.net/TrackMate | ||
Imaging Software | NIS Elements (AR package) | ||
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html | |||
File:TrackMate-manual.pdf | |||
https://github.com/turalaksel/FASTrack | |||
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md |