Визуализация пучка стереоцилий с наноразмерным разрешением в слуховых волосковых клетках живых млекопитающих

Несмотря на то, что пучки стереоцилий в слуховых волосковых клетках достаточно велики, чтобы их можно было визуализировать оптической микроскопией и отклонять в живых клетках в эксперименте с зажимом, основные структурные компоненты механизма трансдукции, такие как кончиковые звенья, могут быть изображены только с помощью электронной микроскопии в мертвых клетках. В слуховых волосковых клетках млекопитающих механизм трансдукции расположен на нижних концах кончиковых звеньев, т. е. на кончиках стереоцилий более короткого ряда¹ и регулируется локально через сигнализацию на кончиках стереоцилий^2,3. Тем не менее, безметочная визуализация поверхностных структур в этом месте в живых волосковых клетках невозможна из-за небольших размеров стереоцилий.

Улитка млекопитающих имеет два типа слуховых сенсорных клеток: внутренние и наружные волосковые клетки. Во внутренних волосковых клетках стереоцилии длиннее и толще по сравнению с стереоцилиями во внешних волосковых клетках^4. Первый и второй ряд стереоцилий имеют диаметр 300-500 нм во внутренних волосковых клетках мыши или крысы. Благодаря дифракции света максимальное разрешение, достижимое при оптической микроскопии без меток, составляет примерно 200 нм. Следовательно, визуализация отдельных стереоцилий в пределах первого и второго рядов внутреннего пучка волосковых клеток относительно проста с помощью оптической микроскопии. Напротив, более короткие рядные стереоцилии во внутренних волосковых клетках и все стереоцилии наружных волосковых клеток имеют диаметр около 100-200 нм и не могут быть визуализированы с помощью оптической микроскопии^5. Несмотря на недавний прогресс в области визуализации со сверхвысоким разрешением, это фундаментальное ограничение сохраняется в любой оптической визуализации без меток. Все современные коммерчески доступные методы сверхвысокого разрешения требуют каких-то флуоресцентных молекул^6,что ограничивает их применение. В дополнение к ограничениям из-за необходимости специфических флуоресцентно помеченных молекул, было показано, что воздействие интенсивного светового облучения вызывает повреждение клеток и может влиять на клеточные процессы, что является большим недостатком при изучении живых клеток^7.

Наши текущие знания об ультраструктурных деталях пучков стереоцилий волосковых клеток были получены в основном с помощью различных методов электронной микроскопии (ЭМ), таких как сканирующая электронная микроскопия (SEM), просвечивающая электронная микроскопия (TEM), замораживание-разрушение EM, а в последнее время с помощью 3D-методов, таких как последовательное сечение с фокусированным ионным пучком или крио-ЭМ томография^{8,9,10,11,12,13, 14,15,16}. К сожалению, все эти методы ЭМ требуют химической или криофиксации образца. В зависимости от временной шкалы явлений это требование делает изучение динамических процессов на кончиках стереоцилий либо невозможным, либо очень трудоемким.

Ограниченные усилия были предприняты для изображения волосяных пучков живых волосковых клеток с помощью атомно-силовой микроскопии (AFM)^17,18. Поскольку AFM работает в физиологических растворах, теоретически он может визуализировать динамические изменения в пучках стереоцилий живых волосковых клеток с течением времени. Проблема заключается в принципах АСМ высокого разрешения, которые подразумевают определенный физический контакт между зондом АСМ и образцом даже в наименее повреждающем режиме «постукивания»^19. Когда зонд AFM сталкивается со стереоцилием, он обычно разбивается о него, повреждая структуру пучка волос. В результате данная методика не подходит для визуализации живых, или даже фиксированных, пучков волосковых клеток^17,18. Проблема может быть частично облегчена с помощью большого шарообразного зонда AFM, который накладывает только гидродинамические силы на поверхность образца^20. Однако, несмотря на то, что такой зонд идеально подходит для проверки механических свойств образца^21,он обеспечивает только субмикрометровое разрешение при визуализации органа Corti²² и по-прежнему применяет к образцу силу, которая может быть существенной для высокочувствительных пучков стереоцилий.

Сканирующая ионно-проводящая микроскопия (SICM) представляет собой версию сканирующей зондовой микроскопии, в которой используется стеклянный пипеточный зонд, заполненный проводящим раствором^23. SICM обнаруживает поверхность, когда пипетка приближается к ячейке и электрический ток через пипетку уменьшается. Поскольку это происходит задолго до прикосновения к клетке, SICM идеально подходит для бесконтактной визуализации живых клеток в физиологическом^{растворе 24.} Наилучшее разрешение SICM составляет порядка одного нанометра, что позволяет разрешать отдельные белковые комплексы на плазматической мембране живой клетки^25. Однако, подобно другим методам сканирования зондов, SICM способен отображать только относительно плоские поверхности. Мы преодолели это ограничение, изобретя прыгающий зондовый ионный электропроводный микроскоп (HPICM)^26,в котором нанопипетка приближается к образцу в каждой точке визуализации(рисунок 1A). Используя HPICM, мы смогли изобразить пучки стереоцилий в живых слуховых волосковых клетках с наноразмерным разрешением^27.

Еще одним фундаментальным преимуществом этого метода является то, что HPICM является не только инструментом визуализации. В отличие от других методов сканирования, зонд HPICM / SICM является электродом, широко используемым в физиологии клеток для электрических записей и локальной доставки различных стимулов. Активность ионных каналов обычно не мешает визуализации HPICM, потому что общий ток через зонд HPICM на несколько порядков больше, чем внеклеточный ток, генерируемый крупнейшими ионными каналами^25. Тем не менее, HPICM позволяет точно позиционировать нанопипетту над интересующей структурой и последующую одноканальную запись патч-зажима из этой структуры^28. Так мы получили первые предварительные записи одноканальной активности на кончиках стереоцилии наружных волосковых клеток^29. Стоит отметить, что даже большой ток через нанопипетку не может произвести значительные изменения потенциала через плазматическую мембрану из-за огромного электрического шунта внеклеточной среды. Однако отдельные ионные каналы могут быть активированы механически протеканием жидкости через нанопипетку³⁰ или химически локальным применением агониста^31.

В HPICM изображение генерируется, когда нанопипетка последовательно приближается к образцу в одной точке, втягивается, а затем движется в боковом направлении, чтобы повторить подход(рисунок 1A). Зажимной усилитель постоянно подает напряжение на провод AgCl в пипетке(рисунок 1B)для генерации тока ~1 нА в растворе ванны. Значение этого тока, когда пипетка находится вдали от поверхности ячейки, определяется как опорный ток(I_ref, рисунок 1C). Затем пипетка перемещается по оси Z, чтобы приблизиться к образцу до тех пор, пока ток не уменьшится на величину, предопределенную пользователем (заданное значение), обычно 0,2%-1% от I_ref (рисунок 1C,верхняя трассировка). Затем система сохраняет значение Z в этот момент как высоту образца вместе с координатами X и Y этой точки изображения. Затем пипетку убирают от поверхности(рисунок 1С,нижняя трассировка) со скоростью, определенной пользователем, обычно 700-900 нм/мс. После втягивания пипетка (или, в нашем случае, образец – см. Рисунок 1В)перемещается латерально к следующей точке визуализации, получается новое значение опорного тока, и пипетка вновь приближается к образцу, повторяя процесс. Движение пипетки X-Y предпочтительно в вертикальном микроскопе, который обычно используется для записи токов механотрансдукции волосковых клеток. В этом случае зонд HPICM приближается к пучкам волосковых клеток не сверху, а под^{углом 32.} Однако наилучшее разрешение визуализации HPICM достигается в установке инвертированного микроскопа(рисунок 1A,B),где движение образца в направлениях X-Y отделено от Z-движения нанопипетки, тем самым устраняя потенциальные механические артефакты.

Используя HPICM, мы получили топографические изображения пучков стереоцилий внутренних и наружных волосковых клеток мыши и крысы и даже визуализировали связи между стереоцилиями, которые составляют около 5 нм в диаметре^26,27. Успех визуализации пучков волосковых клеток с помощью этой техники зависит от нескольких факторов. Во-первых, шум (дисперсия) тока нанопипетки должен быть как можно меньше, чтобы обеспечить минимально возможное заданное значение для визуализации HPICM. Низкое заданное значение позволяет зонду HPICM «ощущать» поверхность стереоцилий на большем расстоянии и под любым углом к приближению зонда и, что удивительно, улучшает разрешение X-Y изображений HPICM (см. Обсуждение). Во-вторых, вибрации и дрейфы в системе должны быть уменьшены до менее чем 10 нм, поскольку они вносят непосредственный вклад в артефакты изображения. Наконец, несмотря на то, что зонд HPICM и ступень образца перемещаются по осям Z и X-Y калиброванными пьезоприводами с обратной связью, которые имеют точность один нанометр или лучше, диаметр наконечника нанопипетки определяет распространение тока (чувствительный объем) и, следовательно, разрешение(рисунок 1A). Поэтому, прежде чем визуализировать живые волосковые клетки, жизненно важно вытащить адекватные пипетки, достичь желаемого разрешения с калибровочными образцами и достичь низкого уровня шума в системе записи.

По крайней мере, пару десятилетий техника SICM не была коммерчески доступна, и она разрабатывалась лишь несколькими лабораториями в мире с ведущей лабораторией профессора Корчева в Имперском колледже (Великобритания). Недавно несколько систем SICM стали коммерчески доступными (см. Таблицу материалов),все из которых основаны на оригинальных принципах HPICM. Тем не менее, визуализация пучков стереоцилий в волосковых клетках требует нескольких пользовательских модификаций, которые технически сложны (или даже невозможны) в закрытых «готовых к работе» системах. Поэтому необходима некоторая интеграция компонентов. Поскольку установка HPICM представляет собой патч-зажим с более строгими требованиями к вибрации и дрейфу и пьезоприводным движением зонда HPICM и образца(рисунок 1D),эта интеграция относительно проста для любого исследователя, который владеет зажимом патча. Тем не менее, ученый без надлежащего образования определенно нуждается в некоторой подготовке в области электрофизиологии в первую очередь. Несмотря на остающиеся проблемы, такие как увеличение скорости визуализации (см. Обсуждение),мы смогли визуализировать пучки стереоцилий в живых волосковых клетках с наноразмерным разрешением, не повреждая их.

В этой статье представлен подробный протокол для выполнения успешной визуализации HPICM живых слуховых пучков волосковых клеток у молодых послеродовых кохлеарных эксплантов крыс или мышей с использованием нашей специальной системы. Интегрированные компоненты перечислены в Таблице материалов. В документе также описываются распространенные проблемы, с которыми можно столкнуться, и способы их устранения.