Stereocilia Bundle Imaging con risoluzione su scala nanometrica in cellule ciliate uditive di mammiferi vivi

Nonostante il fatto che i fasci di stereocilia nelle cellule ciliate uditive siano abbastanza grandi da essere visualizzati al microscopio ottico e deviati nelle cellule vive in un esperimento di patch clamp, i componenti strutturali essenziali del meccanismo di trasduzione come i collegamenti di punta potrebbero essere ripresi solo con la microscopia elettronica nelle cellule morte. Nelle cellule ciliate uditive dei mammiferi, il meccanismo di trasduzione si trova alle estremità inferiori dei collegamenti della punta, cioè alle punte delle stereociglia della fila più corta¹ e regolato localmente attraverso la segnalazione alle punte degli stereocili^2,3. Tuttavia, l’imaging senza etichette delle strutture superficiali in questa posizione nelle cellule ciliate vive non è possibile a causa delle piccole dimensioni degli stereocili.

La coclea dei mammiferi ha due tipi di cellule sensoriali uditive: cellule ciliate interne ed esterne. Nelle cellule ciliate interne, gli stereociglia sono più lunghi e più spessi rispetto a quelli delle cellule ciliate^{esterne 4}. La prima e la seconda fila di stereociglia hanno un diametro di 300-500 nm nelle cellule ciliate interne di topo o ratto. A causa della diffrazione della luce, la risoluzione massima ottenibile con una microscopia ottica senza etichetta è di circa 200 nm. Quindi, la visualizzazione delle singole stereociglia all’interno della prima e della seconda fila del fascio interno di cellule ciliate è relativamente facile con la microscopia ottica. Al contrario, le stereociglia a fila più corte nelle cellule ciliate interne e tutte le stereociglia delle cellule ciliate esterne hanno diametri intorno a 100-200 nm e non possono essere visualizzate con la microscopia ottica⁵. Nonostante i recenti progressi nell’imaging a super-risoluzione, questa limitazione fondamentale persiste in qualsiasi imaging ottico senza etichette. Tutte le attuali tecniche di super-risoluzione disponibili in commercio richiedono una sorta di molecole fluorescenti⁶, che limita le loro applicazioni. Oltre alle limitazioni dovute alla necessità di specifiche molecole marcate fluorescentemente, l’esposizione a un’intensa irradiazione luminosa ha dimostrato di indurre danni cellulari e potrebbe influenzare i processi cellulari, il che è un grande svantaggio quando si studiano le cellule vive⁷.

La nostra attuale conoscenza dei dettagli ultrastrutturali dei fasci di stereociglia delle cellule ciliate è stata ottenuta principalmente con varie tecniche di microscopia elettronica (EM), come la microscopia elettronica a scansione (SEM), la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), la frattura da congelamento EM e recentemente con tecniche 3D come il sezionamento seriale con fascio ionico focalizzato o la tomografia crio-EM^{8,9,10,11,12,13, 14,15,16}. Sfortunatamente, tutte queste tecniche EM richiedono la criofissazione chimica o criofissazione del campione. A seconda della scala temporale dei fenomeni, questo requisito rende impossibile o molto laborioso uno studio dei processi dinamici alle punte degli stereotipi.

Sforzi limitati sono stati fatti per visualizzare fasci di capelli di cellule ciliate vive con microscopia a forza atomica (AFM)^17,18. Poiché l’AFM opera in soluzioni fisiologiche, potrebbe, in teoria, visualizzare i cambiamenti dinamici nei fasci di stereociglia delle cellule ciliate vive nel tempo. Il problema sta nei principi dell’AFM ad alta risoluzione, che implica un certo contatto fisico tra la sonda AFM e il campione, anche nella modalità “tapping” meno dannosa¹⁹. Quando la sonda AFM incontra uno stereocilio, di solito si schianta contro di esso, danneggiando la struttura del fascio di capelli. Di conseguenza, questa tecnica non è adatta per visualizzare dal vivo, o anche fissi, fasci di cellule ciliate^17,18. Il problema può essere parzialmente alleviato utilizzando una grande sonda AFM a forma di sfera che impone solo forze idrodinamiche alla superficie del campione²⁰. Tuttavia, anche se tale sonda è ideale per testare le proprietà meccaniche del campione²¹, fornisce solo una risoluzione sub-micrometrica quando si esegue l’imaging dell’organo di Corti²² e applica ancora al campione una forza che può essere sostanziale per i fasci di stereociglia altamente sensibili.

La microscopia a scansione a conduttanza ionica (SICM) è una versione della microscopia a scansione a sonda che utilizza una sonda a pipetta di vetro riempita con una soluzione conduttiva²³. SICM rileva la superficie quando la pipetta si avvicina alla cella e la corrente elettrica attraverso la pipetta diminuisce. Poiché ciò avviene ben prima di toccare la cellula, il SICM è ideale per l’imaging senza contatto di cellule vive in soluzione fisiologica²⁴. La migliore risoluzione di SICM è dell’ordine dei singoli nanometri, che consente di risolvere singoli complessi proteici sulla membrana plasmatica di una cellula vivente²⁵. Tuttavia, simile ad altre tecniche di scansione della sonda, SICM è in grado di visualizzare solo superfici relativamente piatte. Abbiamo superato questa limitazione inventando il microscopio a conduttanza ionica a sonda luppolabile (HPICM)²⁶, in cui la nanopipetta si avvicina al campione in ogni punto di imaging (Figura 1A). Utilizzando HPICM, siamo stati in grado di visualizzare fasci di stereociglia in cellule ciliate uditive vive con risoluzione su scala nanometrica²⁷.

Un altro vantaggio fondamentale di questa tecnica è che l’HPICM non è solo uno strumento di imaging. A differenza di altre tecniche di scansione della sonda, la sonda HPICM / SICM è un elettrodo ampiamente utilizzato nella fisiologia cellulare per le registrazioni elettriche e la consegna locale di vari stimoli. L’attività del canale ionico di solito non interferisce con l’imaging HPICM, perché la corrente totale attraverso la sonda HPICM è di diversi ordini di grandezza più grande della corrente extracellulare generata dai più grandi canali^{ionici 25}. Tuttavia, HPICM consente il posizionamento preciso della nanopipetta su una struttura di interesse e la successiva registrazione patch-clamp a canale singolo da questa struttura²⁸. È così che abbiamo ottenuto le prime registrazioni preliminari dell’attività a canale singolo alle punte delle stereociglia ciliate^{esterne 29}. Vale la pena ricordare che anche una grande corrente attraverso la nanopipetta non può produrre cambiamenti significativi del potenziale attraverso la membrana plasmatica a causa dell’enorme shunt elettrico del mezzo extracellulare. Tuttavia, i singoli canali ionici possono essere attivati meccanicamente dal flusso di liquido attraverso la nanopipetta³⁰ o chimicamente mediante l’applicazione locale di un agonista³¹.

In HPICM, l’immagine viene generata quando una nanopipetta si avvicina sequenzialmente al campione in un punto, si ritrae e quindi si muove in direzione laterale per ripetere l’approccio (Figura 1A). Un amplificatore patch clamp applica costantemente tensione a un filo AgCl nella pipetta (Figura 1B) per generare una corrente di ~ 1 nA nella soluzione del bagno. Il valore di questa corrente quando la pipetta è lontana dalla superficie della cella è determinato come corrente di riferimento (I_ref, Figura 1C). Quindi, la pipetta si sposta nell’asse Z per avvicinarsi al campione fino a quando la corrente non viene ridotta di una quantità predefinita dall’utente (setpoint), di solito 0,2% -1% del _riferimento I (Figura 1C,traccia superiore). Il sistema salva quindi il valore Z in questo momento come altezza del campione, insieme alle coordinate X e Y di questo punto di imaging. Quindi, la pipetta viene ritratta lontano dalla superficie(Figura 1C,traccia inferiore) ad una velocità definita dall’utente, di solito 700-900 nm / ms. Dopo la retrazione, la pipetta (o, nel nostro caso, il campione – vedi Figura 1B) viene spostata lateralmente al punto di imaging successivo, si ottiene un nuovo valore di corrente di riferimento e la pipetta si avvicina ancora una volta al campione, ripetendo il processo. Il movimento X-Y della pipetta è preferito in una configurazione al microscopio verticale che viene tipicamente utilizzata per le registrazioni delle correnti di meccanotrasduzione delle cellule ciliate. In questa impostazione, la sonda HPICM si avvicina ai fasci di cellule ciliate non dall’alto ma con un angolo³². Tuttavia, la migliore risoluzione dell’imaging HPICM si ottiene in una configurazione al microscopio invertito (Figura 1A,B), in cui il movimento del campione nelle direzioni X-Y viene disaccoppiato dal movimento Z della nanopipetta, eliminando così potenziali artefatti meccanici.

Utilizzando HPICM, abbiamo ottenuto immagini topografiche di fasci di stereociglia interne ed esterne di cellule ciliate interne ed esterne di topo e abbiamo persino visualizzato i collegamenti tra le stereociglia che sono di circa 5 nm di diametro^26,27. Il successo dell’imaging a fascio di cellule ciliate con questa tecnica si basa su diversi fattori. In primo luogo, il rumore (varianza) della corrente della nanopipetta dovrebbe essere il più piccolo possibile per consentire il setpoint più basso possibile per l’imaging HPICM. Un setpoint basso consente alla sonda HPICM di “rilevare” la superficie stereocilia a una distanza maggiore e con qualsiasi angolo rispetto all’approccio della sonda e, sorprendentemente, migliora la risoluzione X-Y dell’imaging HPICM (vedi Discussione). In secondo luogo, le vibrazioni e le derive nel sistema dovrebbero essere ridotte a meno di 10 nm, poiché contribuiscono direttamente agli artefatti di imaging. Infine, anche se la sonda HPICM e lo stadio del campione sono spostati sugli assi Z e X-Y dagli attuatori piezoelettrici calibrati controllati da feedback che hanno una precisione di un singolo nanometro o superiore, il diametro della punta della nanopipetta determina la diffusione della corrente (volume di rilevamento) e quindi la risoluzione (Figura 1A). Pertanto, prima di eseguire l’imaging di cellule ciliate vive, è fondamentale tirare le pipette adeguate, raggiungere la risoluzione desiderata con campioni di calibrazione e ottenere un basso rumore nel sistema di registrazione.

Per almeno un paio di decenni, la tecnica SICM non è stata disponibile in commercio ed è stata sviluppata solo da pochi laboratori al mondo con il laboratorio leader del Prof. Korchev nell’Imperial College (Regno Unito). Recentemente, diversi sistemi SICM sono diventati disponibili in commercio (vedi Tabella dei materiali),tutti basati sui principi ORIGINALI HPICM. Tuttavia, l’imaging di fasci di stereocilia nelle cellule ciliate richiede diverse modifiche personalizzate che sono tecnicamente impegnative (o addirittura impossibili) nei sistemi chiusi “pronti all’uso”. Pertanto, è necessaria una certa integrazione dei componenti. Poiché la configurazione HPICM rappresenta un patch clamp rig con requisiti di vibrazione e deriva più rigorosi e un movimento piezoelettrico della sonda HPICM e del campione (Figura 1D), questa integrazione è relativamente facile per qualsiasi ricercatore, che è esperto nel patch clamping. Tuttavia, uno scienziato senza un background adeguato avrebbe sicuramente bisogno di una formazione in elettrofisiologia prima. Nonostante le sfide rimanenti come l’aumento della velocità di imaging (vedi Discussione), siamo stati in grado di visualizzare fasci di stereocilia in cellule ciliate vive con risoluzione su scala nanometrica senza danneggiarle.

Questo documento presenta un protocollo dettagliato per eseguire con successo l’imaging HPICM dei fasci di cellule ciliate uditive vive in giovani espianti cocleari di ratto postnatale o topo utilizzando il nostro sistema personalizzato. I componenti integrati sono elencati nella Tabella dei Materiali. Il documento descrive anche i problemi comuni che possono essere riscontrati e come risolverli.