Imagem do pacote de esterecilia com resolução de nanoescala em células capilares auditivas de mamíferos vivos

Apesar do fato de que os feixes de estereocilia nas células ciliadas auditivas são grandes o suficiente para serem visualizados por microscopia óptica e desviados em células vivas em um experimento de grampo de remendo, os componentes estruturais essenciais da máquina de transdução, como as ligações de ponta, poderiam ser visualizados apenas com a microscopia eletrônica em células mortas. Nas células ciliadas auditivas dos mamíferos, o maquinário de transdução está localizado nas extremidades inferiores das pontas, ou seja, nas pontas da linha mais curta esterecilia¹ e regulado localmente através da sinalização nas pontas da estereócilia^2,3. No entanto, imagens livres de rótulos das estruturas superficiais neste local em células ciliadas vivas não são possíveis devido aos pequenos tamanhos de estereócilia.

A cóclea dos mamíferos tem dois tipos de células sensoriais auditivas: células ciliares internas e externas. Nas células ciliadas internas, estereócilias são mais longas e grossas em comparação com as das células ciliadas externas⁴. A primeira e segunda fileira de estereócilia têm um diâmetro de 300-500 nm em células ciliadas internas de rato ou rato. Devido à difração da luz, a resolução máxima alcançável com uma microscopia óptica sem rótulos é de aproximadamente 200 nm. Assim, a visualização de estereócilias individuais dentro da primeira e segunda fileiras do feixe de células ciliadas internas é relativamente fácil com microscopia óptica. Em contraste, estereócilias de linha mais curtas nas células ciliadas internas e todos os estereocilias das células ciliadas externas têm diâmetros em torno de 100-200 nm e não podem ser visualizados com microscopia óptica⁵. Apesar dos recentes progressos em imagens de super resolução, essa limitação fundamental persiste em qualquer imagem óptica livre de rótulos. Todas as técnicas de super-resolução disponíveis comercialmente atuais requerem algum tipo de moléculas fluorescentes^6,o que limita suas aplicações. Além das limitações devido à necessidade de moléculas marcadas fluorescentes específicas, a exposição à intensa irradiação de luz tem sido demonstrada para induzir danos celulares e pode influenciar os processos celulares, o que é uma grande desvantagem ao estudar células vivas⁷.

Nosso conhecimento atual dos detalhes ultraestruturais dos feixes de esterecicia de células ciliares tem sido obtido principalmente com várias técnicas de microscopia eletrônica (EM), como microscopia eletrônica de varredura (SEM), microscopia eletrônica de transmissão (TEM), em11 , fratura congelante, e recentemente com técnicas 3D como seção serial com feixe de íons focado ou tomografia crio-EM^{8,9,10, 11,12}, 13^,13 ,^{13, 14,15,16}. Infelizmente, todas essas técnicas EM requerem química ou criofixação da amostra. Dependendo da escala de tempo dos fenômenos, essa exigência torna impossível ou muito trabalhoso um estudo dos processos dinâmicos nas pontas da estereócilia, seja impossível ou muito trabalhoso.

Esforços limitados foram feitos para a imagem de feixes de cabelo de células ciliar vivas com microscopia de força atômica (AFM)^17,18. Uma vez que a AFM opera em soluções fisiológicas, poderia, em teoria, visualizar mudanças dinâmicas nos feixes de estereócilia de células ciliadas vivas ao longo do tempo. O problema está nos princípios da AFM de alta resolução, o que implica certo contato físico entre a sonda AFM e a amostra, mesmo no modo menos prejudicial de “tocar”¹⁹. Quando a sonda AFM encontra um estereócil, geralmente se depara com ele, danificando a estrutura do feixe de cabelo. Como resultado, essa técnica não é adequada para visualizar células ciliar vivas, ou mesmo fixas, feixes de células^{ciliares 17,18}. O problema pode ser parcialmente aliviado usando uma grande sonda AFM em forma de bola que impõe apenas forças hidrodinâmicas à superfície da amostra²⁰. No entanto, embora tal sonda seja idealmente adequada para testar propriedades mecânicas da amostra^21,ela fornece apenas uma resolução de sub micrômetro ao fotografar o órgão de Corti²² e ainda se aplica à amostra uma força que pode ser substancial para os feixes de estereócilia altamente sensíveis.

A microscopia de condução de íons de varredura (SICM) é uma versão da microscopia da sonda de varredura que usa uma sonda pipeta de vidro preenchida com uma solução condutora²³. O SICM detecta a superfície quando a pipeta se aproxima da célula e a corrente elétrica através da pipeta diminui. Uma vez que isso está acontecendo bem antes de tocar a célula, o SICM é ideal para imagens não contato de células vivas na solução fisiológica²⁴. A melhor resolução do SICM está na ordem dos nanômetros únicos, o que permite resolver complexos proteicos individuais na membrana plasmática de uma célula viva²⁵. No entanto, semelhante a outras técnicas de sonda de digitalização, o SICM é capaz de imagem apenas superfícies relativamente planas. Superamos essa limitação inventando microscópio de condução de íons de ânhão de ânion de guinada (HPICM)²⁶, no qual a nanopipette se aproxima da amostra em cada ponto de imagem(Figura 1A). Usando hpicm, conseguimos imaginar feixes de estereocilia em células ciliadas auditivas vivas com resolução nanoescala²⁷.

Outra vantagem fundamental dessa técnica é que o HPICM não é apenas uma ferramenta de imagem. Em contraste com outras técnicas de sonda de varredura, a sonda HPICM/SICM é um eletrodo amplamente utilizado na fisiologia celular para gravações elétricas e entrega local de vários estímulos. A atividade do canal de íons geralmente não interfere com a imagem HPICM, porque a corrente total através da sonda HPICM é várias ordens de magnitude maior do que a corrente extracelular gerada pelos maiores canais de^{íons 25}. No entanto, o HPICM permite um posicionamento preciso da nanopipette sobre uma estrutura de interesse e posterior gravação de grampo de remendo de um canal único a partir desta estrutura²⁸. Foi assim que obtivemos as primeiras gravações preliminares de atividade de canal único nas pontas da estereócilia da célula ciliada²⁹. Vale ressaltar que mesmo uma grande corrente através da nanopipette não pode produzir mudanças significativas do potencial através da membrana plasmática devido ao enorme desvio elétrico do meio extracelular. No entanto, canais de íons individuais podem ser ativados mecanicamente pelo fluxo de líquido através da nanopipette³⁰ ou quimicamente por aplicação local de um agonista³¹.

No HPICM, a imagem é gerada quando uma nanopipette sequencialmente se aproxima da amostra em um ponto, se retrai e, em seguida, se move na direção lateral para repetir a abordagem(Figura 1A). Um amplificador de remendo aplica constantemente tensão a um fio AgCl na pipeta (Figura 1B) para gerar uma corrente de ~1 nA na solução de banho. O valor dessa corrente quando a pipeta está longe da superfície da célula é determinado como uma corrente de referência (I_ref, Figura 1C). Em seguida, a pipeta se move no eixo Z para se aproximar da amostra até que a corrente seja reduzida por uma quantidade predefinida pelo usuário (setpoint), geralmente 0,2%-1% do I_ref (Figura 1C, traço superior). O sistema então economiza valor Z neste momento como a altura da amostra, juntamente com coordenadas X e Y deste ponto de imagem. Em seguida, a pipeta é retraída para longe da superfície(Figura 1C, traço inferior) a uma velocidade definida pelo usuário, geralmente 700-900 nm/ms. Após a retração, a pipeta (ou, no nosso caso, a amostra – ver Figura 1B) é movida lateralmente para o próximo ponto de imagem, um novo valor atual de referência é obtido, e a pipeta se aproxima mais uma vez da amostra, repetindo o processo. O movimento X-Y da pipeta é preferido em uma configuração de microscópio vertical que é normalmente usada para gravações das correntes de mecanotransdução das células ciliares. Nesta configuração, a sonda HPICM se aproxima dos feixes de células ciliares não do topo, mas de um ângulo³². No entanto, a melhor resolução da imagem HPICM é alcançada em uma configuração de microscópio invertido (Figura 1A,B), onde o movimento da amostra nas direções X-Y é desacoplado do movimento Z da nanopipette, eliminando assim potenciais artefatos mecânicos.

Usando hpicm, obtivemos imagens topográficas de feixes de esterecilia de células ciliadas internas e externas de ratos, e até visualizamos as ligações entre os estereocilias que têm cerca de 5 nm de diâmetro^26,27. O sucesso da imagem do feixe de células ciliares com essa técnica conta com vários fatores. Primeiro, o ruído (variância) da corrente de nanopipette deve ser o menor possível para permitir o menor ponto de configuração possível para imagens HPICM. Um ponto de setpoint baixo permite que a sonda HPICM “sinta” a superfície estereócilia a uma distância maior e em qualquer ângulo para a abordagem da sonda e, surpreendentemente, melhora a resolução X-Y da imagem HPICM (ver Discussão). Em segundo lugar, as vibrações e derivas no sistema devem ser reduzidas para menos de 10 nm, uma vez que contribuem diretamente para os artefatos de imagem. Finalmente, mesmo que a sonda HPICM e o estágio da amostra sejam movidos em eixos Z e X-Y pelos atuadores piezo controlados por feedback calibrado que têm uma precisão de um único nanômetro ou melhor, o diâmetro da ponta de nanopipette determina a propagação da corrente (volume de sensoriamento) e, portanto, a resolução(Figura 1A). Portanto, antes de imaginar células ciliar vivas, é vital puxar as pipetas adequadas, alcançar a resolução desejada com amostras de calibração e obter baixo ruído no sistema de gravação.

Há pelo menos algumas décadas, a técnica sicm não está disponível comercialmente e vem sendo desenvolvida por poucos laboratórios no mundo com o laboratório líder do Prof. Korchev no Imperial College (Reino Unido). Recentemente, vários sistemas SICM tornaram-se comercialmente disponíveis (ver Tabela de Materiais), todos baseados nos princípios originais do HPICM. No entanto, os feixes de esterecilia de imagem nas células ciliadas exigem várias modificações personalizadas que são tecnicamente desafiadoras (ou até mesmo impossíveis) nos sistemas fechados “prontos para ir”. Portanto, é necessária alguma integração de componentes. Uma vez que a configuração HPICM representa uma plataforma de fixação com requisitos mais rigorosos de vibração e deriva e um movimento piezo-driven da sonda HPICM e da amostra (Figura 1D), essa integração é relativamente fácil para qualquer pesquisador, que é proficiente em fixação de patches. No entanto, um cientista sem experiência adequada definitivamente precisaria de algum treinamento em eletrofisiologia primeiro. Apesar dos desafios restantes, como o aumento da velocidade da imagem (ver Discussão),temos sido capazes de imaginar feixes de esterecilia em células ciliadas vivas com resolução de nanoescala sem danificá-las.

Este artigo apresenta um protocolo detalhado para realizar imagens hpicm bem sucedidas dos pacotes de células capilares auditivas ao vivo em jovens explants cocleares pós-natal ou rato usando nosso sistema personalizado. Os componentes integrados estão listados na Tabela de Materiais. O artigo também descreve problemas comuns que podem ser encontrados e como solucioná-los.