Stereozilien-Bündelbildgebung mit nanoskaliger Auflösung in lebenden Säugetier-Hörhaarzellen

Trotz der Tatsache, dass Stereozilienbündel in den auditiven Haarzellen groß genug sind, um durch optische Mikroskopie sichtbar gemacht und in einem Patch-Clamp-Experiment in lebenden Zellen abgelenkt zu werden, konnten die wesentlichen strukturellen Komponenten der Transduktionsmaschinerie wie Spitzenverbindungen nur mit der Elektronenmikroskopie in toten Zellen abgebildet werden. In den Säugetier-Hörhaarzellen befindet sich die Transduktionsmaschinerie an den unteren Enden der Spitzenverbindungen, d.h. an den Spitzen der kürzeren Reihe Stereozilien¹ und wird lokal durch die Signalübertragung an den Spitzen der Stereozilien^2,3reguliert. Eine markierungsfreie Abbildung der Oberflächenstrukturen an dieser Stelle in lebenden Haarzellen ist jedoch aufgrund der geringen Größe von Stereozilien nicht möglich.

Die Cochlea von Säugetieren hat zwei Arten von auditiven Sinneszellen: innere und äußere Haarzellen. In den inneren Haarzellen sind Stereozilien länger und dicker als in den äußeren Haarzellen⁴. Die erste und zweite Reihe von Stereozilien haben einen Durchmesser von 300-500 nm in inneren Haarzellen von Mäusen oder Ratten. Durch die Beugung des Lichts beträgt die maximale Auflösung, die mit einer markierungsfreien optischen Mikroskopie erreicht werden kann, etwa 200 nm. Daher ist die Visualisierung einzelner Stereozilien in der ersten und zweiten Reihe des inneren Haarzellbündels mit der optischen Mikroskopie relativ einfach. Im Gegensatz dazu haben kürzere Stereozilien in den inneren Haarzellen und alle Stereozilien der äußeren Haarzellen Durchmesser um 100-200 nm und können mit optischer Mikroskopie nicht sichtbar gemacht werden⁵. Trotz der jüngsten Fortschritte bei der hochauflösenden Bildgebung besteht diese grundlegende Einschränkung bei jeder optischen, markierungsfreien Bildgebung fort. Alle derzeit kommerziell erhältlichen Superauflösungstechniken erfordern eine Art fluoreszierende Moleküle⁶, was ihre Anwendungen einschränkt. Zusätzlich zu den Einschränkungen aufgrund des Bedarfs an spezifischen fluoreszenzmarkierten Molekülen hat sich gezeigt, dass die Exposition gegenüber intensiver Lichtbestrahlung zelluläre Schäden induziert und zelluläre Prozesse beeinflussen könnte, was bei der Untersuchung lebender Zellen ein großer Nachteil ist⁷.

Unser aktuelles Wissen über die ultrastrukturellen Details von Haarzell-Stereozilienbündeln wurde hauptsächlich mit verschiedenen Elektronenmikroskopietechniken (EM) wie Rasterelektronenmikroskopie (REM), Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Gefrierbruch-EM und kürzlich mit 3D-Techniken wie seriellem Schnitt mit fokussiertem Ionenstrahl oder Kryo-EM-Tomographie^8,9^{,10,11,12,13, 14,15,16}. Leider erfordern alle diese EM-Techniken eine chemische oder Kryofixierung der Probe. Abhängig von der Zeitskala der Phänomene macht diese Anforderung eine Untersuchung der dynamischen Prozesse an den Spitzen der Stereozilien entweder unmöglich oder sehr arbeitsintensiv.

Es wurden begrenzte Anstrengungen unternommen, um Haarbündel lebender Haarzellen mit Rasterkraftmikroskopie (AFM)^{abzubilden 17,18}. Da AFM in physiologischen Lösungen arbeitet, könnte es theoretisch dynamische Veränderungen in den Stereozilienbündeln lebender Haarzellen im Laufe der Zeit visualisieren. Das Problem liegt in den Prinzipien des hochauflösenden AFM, das einen gewissen physikalischen Kontakt zwischen der AFM-Sonde und der Probe impliziert, selbst im am wenigsten schädlichen “Tapping” -Modus¹⁹. Wenn die AFM-Sonde auf ein Stereocilium trifft, prallt sie normalerweise dagegen und beschädigt die Struktur des Haarbündels. Infolgedessen ist diese Technik nicht geeignet, um lebende oder sogar feste Haarzellenbündel^{17,18 zu visualisieren.} Das Problem kann teilweise durch die Verwendung einer großen kugelförmigen AFM-Sonde gelindert werden, die nur hydrodynamische Kräfte auf die Oberfläche der Probe ausübt²⁰. Obwohl eine solche Sonde ideal geeignet ist, um die mechanischen Eigenschaften der Probe²¹zu testen, liefert sie bei der Abbildung des Corti^22-Organs nur eine Auflösung im Submikrometerbereich und übt dennoch eine Kraft auf die Probe aus, die für die hochempfindlichen Stereozilienbündel erheblich sein kann.

Die Rasterionenleitwertmikroskopie (SICM) ist eine Version der Rastersondenmikroskopie, bei der eine Glaspipettensonde verwendet wird, die mit einer leitfähigen Lösung gefüllt ist²³. SICM erkennt die Oberfläche, wenn sich die Pipette der Zelle nähert und der elektrische Strom durch die Pipette abnimmt. Da dies lange vor dem Berühren der Zelle geschieht, eignet sich das SICM ideal für die berührungslose Bildgebung lebender Zellen in physiologischer Lösung²⁴. Die beste Auflösung von SICM liegt in der Größenordnung von einzelnen Nanometern, was die Auflösung einzelner Proteinkomplexe an der Plasmamembran einer lebenden Zelle^{ermöglicht 25}. Ähnlich wie andere Rastersondentechniken ist SICM jedoch in der Lage, nur relativ flache Oberflächen abzubilden. Wir haben diese Einschränkung überwunden, indem wir das Hopping-Probe-Ionenleitfähigkeitsmikroskop (HPICM)²⁶erfunden haben, bei dem sich die Nanopipette an jedem Bildgebungspunkt der Probe nähert (Abbildung 1A). Mit HPICM konnten wir Stereozilienbündel in lebenden auditiven Haarzellen mit nanoskaliger Auflösung^{27 abbilden.}

Ein weiterer grundlegender Vorteil dieser Technik ist, dass HPICM nicht nur ein bildgebendes Werkzeug ist. Im Gegensatz zu anderen Rastersondentechniken ist die HPICM/SICM-Sonde eine Elektrode, die in der Zellphysiologie für elektrische Aufzeichnungen und die lokale Abgabe verschiedener Reize weit verbreitet ist. Die Ionenkanalaktivität stört die HPICM-Bildgebung normalerweise nicht, da der Gesamtstrom durch die HPICM-Sonde um mehrere Größenordnungen größer ist als der extrazelluläre Strom, der von den größten Ionenkanälen erzeugt wird²⁵. HPICM ermöglicht jedoch die präzise Positionierung der Nanopipette über einer interessierenden Struktur und die anschließende einkanalige Patch-Clamp-Aufzeichnung von dieser Struktur²⁸. So erhielten wir die ersten Voraufnahmen der Einkanalaktivität an den Spitzen der äußeren Haarzelle Stereozilien²⁹. Es ist erwähnenswert, dass selbst ein großer Strom durch die Nanopipette aufgrund des enormen elektrischen Shunts des extrazellulären Mediums keine signifikanten Änderungen des Potentials über die Plasmamembran erzeugen kann. Einzelne Ionenkanäle können jedoch mechanisch durch Flüssigkeitsfluss durch die Nanopipette³⁰ oder chemisch durch lokale Anwendung eines Agonisten³¹aktiviert werden.

In HPICM wird das Bild erzeugt, wenn sich eine Nanopipette an einem Punkt sequentiell der Probe nähert, sich zurückzieht und sich dann in lateraler Richtung bewegt, um die Annäherung zu wiederholen (Abbildung 1A). Ein Patch-Clamp-Verstärker legt ständig Spannung an einen AgCl-Draht in der Pipette an (Abbildung 1B), um einen Strom von ~ 1 nA in der Badlösung zu erzeugen. Der Wert dieses Stroms, wenn die Pipette von der Oberfläche der Zelle entfernt ist, wird als Referenzstrom bestimmt (I_ref, Abbildung 1C). Dann bewegt sich die Pipette in der Z-Achse, um sich der Probe zu nähern, bis der Strom um einen vom Benutzer vordefinierten Betrag (Sollwert) reduziert wird, normalerweise 0,2% -1% der _I-Referenz (Abbildung 1C,obere Spur). Das System speichert dann in diesem Moment den Z-Wert als Höhe der Probe zusammen mit X- und Y-Koordinaten dieses Abbildungspunkts. Dann wird die Pipette von der Oberfläche weggezogen(Abbildung 1C,untere Spur) mit einer vom Benutzer definierten Geschwindigkeit, normalerweise 700-900 nm/ms. Nach dem Zurückziehen wird die Pipette (oder in unserem Fall die Probe – siehe Abbildung 1B) seitlich zum nächsten Bildgebungspunkt bewegt, ein neuer Referenzstromwert wird erhalten, und die Pipette nähert sich erneut der Probe und wiederholt den Vorgang. Die X-Y-Bewegung der Pipette wird in einem aufrechten Mikroskopaufbau bevorzugt, der typischerweise für Aufzeichnungen der Mechanotransduktionsströme der Haarzellen verwendet wird. In dieser Einstellung nähert sich die HPICM-Sonde den Haarzellbündeln nicht von oben, sondern in einem Winkel^{von 32}. Die beste Auflösung der HPICM-Bildgebung wird jedoch in einem inversen Mikroskopaufbau (Abbildung 1A,B) erreicht, bei dem die Bewegung der Probe in X-Y-Richtung von der Z-Bewegung der Nanopipette entkoppelt wird, wodurch potenzielle mechanische Artefakte eliminiert werden.

Mit HPICM erhielten wir topographische Bilder von inneren und äußeren Haarzellen-Stereozilienbündeln von Maus und Ratte und visualisierten sogar die Verbindungen zwischen den Stereozilien mit einem Durchmesser von etwa 5 nm^26,27. Der Erfolg der Haarzellbündelbildgebung mit dieser Technik hängt von mehreren Faktoren ab. Erstens sollte das Rauschen (Varianz) des Nanopipettenstroms so gering wie möglich sein, um einen möglichst niedrigen Sollwert für die HPICM-Bildgebung zu ermöglichen. Ein niedriger Sollwert ermöglicht es der HPICM-Sonde, die Stereozillenoberfläche in einem größeren Abstand und in jedem Winkel zum Sondenansatz zu “erfassen” und überraschenderweise die X-Y-Auflösung der HPICM-Bildgebung zu verbessern (siehe Diskussion). Zweitens sollten die Vibrationen und Drifts im System auf weniger als 10 nm reduziert werden, da sie direkt zu den bildgebenden Artefakten beitragen. Obwohl die HPICM-Sonde und der Probentisch in der Z- und X-Y-Achse von den kalibrierten rückkopplungsgesteuerten Piezoaktuatoren bewegt werden, die eine Genauigkeit von einem Nanometer oder besser haben, bestimmt der Durchmesser der Nanopipettenspitze die Ausbreitung des Stroms (Erfassungsvolumen) und damit die Auflösung (Abbildung 1A). Daher ist es vor der Bildgebung lebender Haarzellen wichtig, die entsprechenden Pipetten zu ziehen, die gewünschte Auflösung mit Kalibrierproben zu erreichen und ein geringes Rauschen im Aufnahmesystem zu erreichen.

Seit mindestens ein paar Jahrzehnten ist die SICM-Technik nicht mehr kommerziell verfügbar und wurde nur von wenigen Labors auf der Welt mit dem führenden Labor von Prof. Korchev am Imperial College (UK) entwickelt. In jüngster Zeit sind mehrere SICM-Systeme kommerziell verfügbar geworden (siehe Materialtabelle),die alle auf den ursprünglichen HPICM-Prinzipien basieren. Die Abbildung von Stereozilienbündeln in den Haarzellen erfordert jedoch mehrere kundenspezifische Modifikationen, die in den geschlossenen “ready-to-go”-Systemen technisch anspruchsvoll (oder sogar unmöglich) sind. Daher ist eine gewisse Komponentenintegration erforderlich. Da der HPICM-Aufbau ein Patch-Clamp-Rig mit strengeren Vibrations- und Driftanforderungen und einer piezogetriebenen Bewegung der HPICM-Sonde und der Probe darstellt (Abbildung 1D), ist diese Integration für jeden Forscher, der sich mit Patch-Clamping auskennt, relativ einfach. Ein Wissenschaftler ohne richtigen Hintergrund würde jedoch definitiv zuerst eine Ausbildung in Elektrophysiologie benötigen. Trotz verbleibender Herausforderungen wie der Erhöhung der Bildgebungsgeschwindigkeit (siehe Diskussion)konnten wir Stereozilienbündel in lebenden Haarzellen mit nanoskaliger Auflösung abbilden, ohne sie zu beschädigen.

Dieses Papier stellt ein detailliertes Protokoll vor, um eine erfolgreiche HPICM-Bildgebung der lebenden auditiven Haarzellbündel in jungen postnatalen Ratten- oder Maus-Cochlea-Explantaten mit unserem benutzerdefinierten System durchzuführen. Die integrierten Komponenten sind in der Materialtabelle aufgeführt. In diesem Dokument werden auch häufige Probleme beschrieben, die auftreten können, und wie Sie diese beheben können.