Stereocilia bundel beeldvorming met nanoschaalresolutie in levende auditieve haarcellen van zoogdieren

Ondanks het feit dat stereociliabundels in de auditieve haarcellen groot genoeg zijn om te worden gevisualiseerd door optische microscopie en afgebogen in levende cellen in een patchklemexperiment, konden de essentiële structurele componenten van de transductiemachinerie zoals tiplinks alleen worden afgebeeld met de elektronenmicroscopie in dode cellen. In de auditieve haarcellen van zoogdieren bevindt de transductiemachinerie zich aan de onderkant van de tiplinks, d.w.z. aan de uiteinden van de kortere rij stereocilia¹ en lokaal geregeld door de signalering aan de uiteinden van stereocilia^2,3. Toch is labelvrije beeldvorming van de oppervlaktestructuren op deze locatie in levende haarcellen niet mogelijk vanwege de kleine afmetingen van stereocilia.

Het slakkenhuis van zoogdieren heeft twee soorten auditieve sensorische cellen: binnenste en buitenste haarcellen. In de binnenste haarcellen zijn stereocilia langer en dikker in vergelijking met die in de buitenste haarcellen⁴. De eerste en tweede rij stereocilia hebben een diameter van 300-500 nm in binnenste haarcellen van muizen of ratten. Door de diffractie van licht is de maximale resolutie die haalbaar is met een labelvrije optische microscopie ongeveer 200 nm. Vandaar dat visualisatie van individuele stereocilia binnen de eerste en tweede rij van de binnenste haarcelbundel relatief eenvoudig is met optische microscopie. Daarentegen hebben kortere rijen stereocilia in de binnenste haarcellen en alle stereocilia van de buitenste haarcellen diameters rond 100-200 nm en kunnen niet worden gevisualiseerd met optische microscopie⁵. Ondanks de recente vooruitgang in superresolutiebeeldvorming, blijft deze fundamentele beperking bestaan in elke optische labelvrije beeldvorming. Alle huidige commercieel verkrijgbare superresolutietechnieken vereisen een soort fluorescerende^{moleculen 6}, wat hun toepassingen beperkt. Naast beperkingen als gevolg van de behoefte aan specifieke fluorescerend gelabelde moleculen, is aangetoond dat blootstelling aan intense lichtbestraling cellulaire schade veroorzaakt en cellulaire processen kan beïnvloeden, wat een groot nadeel is bij het bestuderen van levende cellen⁷.

Onze huidige kennis van de ultrastructurele details van haarcel stereocilia bundels is meestal verkregen met verschillende elektronenmicroscopie (EM) technieken, zoals scanning elektronenmicroscopie (SEM), transmissie elektronenmicroscopie (TEM), freeze-fracture EM, en onlangs met 3D-technieken zoals seriële sectie met gerichte ionenbundel of cryo-EM tomografie^{8,9,10,11,12,13, 14,15,16}. Helaas vereisen al deze EM-technieken chemische of cryofixatie van het monster. Afhankelijk van de tijdschaal van de verschijnselen, maakt deze vereiste een studie van de dynamische processen aan de uiteinden van stereocilia onmogelijk of zeer arbeidsintensief.

Er zijn beperkte inspanningen geleverd om haarbundels van levende haarcellen in beeld te brengen met atoomkrachtmicroscopie (AFM)^17,18. Omdat AFM in fysiologische oplossingen werkt, zou het in theorie dynamische veranderingen in de stereociliabundels van levende haarcellen in de loop van de tijd kunnen visualiseren. Het probleem ligt in de principes van hoge resolutie AFM, wat een zeker fysiek contact tussen de AFM-sonde en het monster impliceert, zelfs in de minst schadelijke “tapmodus”¹⁹. Wanneer de AFM-sonde een stereocilium tegenkomt, crasht deze er meestal tegenaan en beschadigt de structuur van de haarbundel. Als gevolg hiervan is deze techniek niet geschikt voor het visualiseren van levende of zelfs vaste haarcellenbundels^17,18. Het probleem kan gedeeltelijk worden verlicht door een grote balvormige AFM-sonde te gebruiken die alleen hydrodynamische krachten oplegt aan het oppervlak van het monster²⁰. Hoewel een dergelijke sonde bij uitstek geschikt is om de mechanische eigenschappen van het monster²¹te testen, biedt deze slechts een resolutie van minder dan een micrometer bij het afbeelden van het orgaan van Corti²² en past het nog steeds een kracht toe op het monster die aanzienlijk kan zijn voor de zeer gevoelige stereociliabundels.

Scanning ion conductance microscopie (SICM) is een versie van scanning probe microscopie die gebruik maakt van een glazen pipet sonde gevuld met een geleidende oplossing²³. SICM detecteert het oppervlak wanneer de pipet de cel nadert en de elektrische stroom door de pipet afneemt. Omdat dit gebeurt ruim voordat de cel wordt aangeraakt, is de SICM bij uitstek geschikt voor contactloze beeldvorming van levende cellen in fysiologische oplossing²⁴. De beste resolutie van SICM is in de orde van enkele nanometers, waarmee individuele eiwitcomplexen kunnen worden opgelost bij het plasmamembraan van een levende cel²⁵. Net als bij andere scanning probe-technieken is SICM echter in staat om alleen relatief vlakke oppervlakken in beeld te brengen. We hebben deze beperking overwonnen door het uitvinden van de hoppende sonde ionengeleidingsmicroscoop (HPICM)²⁶, waarbij de nanopipette het monster op elk beeldvormingspunt nadert (Figuur 1A). Met behulp van HPICM konden we stereociliabundels in levende auditieve haarcellen met nanoschaalresolutie^{27 in}beeld brengen.

Een ander fundamenteel voordeel van deze techniek is dat HPICM niet alleen een imaging tool is. In tegenstelling tot andere scanning probe technieken, is de HPICM/SICM probe een elektrode die veel gebruikt wordt in de celfysiologie voor elektrische opnames en lokale afgifte van verschillende stimuli. Ionkanaalactiviteit interfereert meestal niet met HPICM-beeldvorming, omdat de totale stroom door de HPICM-sonde enkele ordes van grootte groter is dan de extracellulaire stroom die wordt gegenereerd door de grootste ionkanalen²⁵. HPICM maakt echter een nauwkeurige positionering van de nanopipette over een interessante structuur en daaropvolgende eenkanaals patch-clamp-opname van deze structuur^{mogelijk 28}. Dit is hoe we de eerste voorlopige opnames van eenkanaalsactiviteit aan de uiteinden van de buitenste haarcel stereocilia²⁹verkregen . Het is vermeldenswaard dat zelfs een grote stroom door de nanopipette geen significante veranderingen van het potentieel over het plasmamembraan kan veroorzaken als gevolg van enorme elektrische shunt van het extracellulaire medium. Individuele ionkanalen kunnen echter mechanisch worden geactiveerd door vloeistofstroom door de nanopipette³⁰ of chemisch door lokale toepassing van een agonist³¹.

In HPICM wordt het beeld gegenereerd wanneer een nanopipette het monster op een bepaald punt achtereenvolgens nadert, zich terugtrekt en vervolgens in laterale richting beweegt om de benadering te herhalen (Figuur 1A). Een patchklemversterker past constant spanning toe op een AgCl-draad in de pipet(figuur 1B)om een stroom van ~ 1 nA in de badoplossing te genereren. De waarde van deze stroom wanneer de pipet zich van het oppervlak van de cel bevindt, wordt bepaald als een referentiestroom (I_ref, Figuur 1C). Vervolgens beweegt de pipet in de Z-as om het monster te benaderen totdat de stroom wordt verminderd met een hoeveelheid die vooraf is gedefinieerd door de gebruiker (instelpunt), meestal 0,2% -1% van de I_ref (figuur 1C, bovenste trace). Het systeem slaat vervolgens de Z-waarde op dit moment op als de hoogte van het monster, samen met X- en Y-coördinaten van dit beeldpunt. Vervolgens wordt de pipet weggetrokken van het oppervlak(figuur 1C,onderste spoor) met een snelheid die door de gebruiker is gedefinieerd, meestal 700-900 nm / ms. Na intrekking wordt de pipet (of, in ons geval, het monster – zie figuur 1B) zijdelings naar het volgende beeldvormingspunt verplaatst, wordt een nieuwe referentiestroomwaarde verkregen en nadert de pipet opnieuw het monster en herhaalt het proces. De X-Y-beweging van de pipet heeft de voorkeur in een rechtopstaande microscoopopstelling die meestal wordt gebruikt voor opnames van de mechanotransductiestromen van de haarcel. In deze instelling benadert de HPICM-sonde de haarcelbundels niet van bovenaf, maar onder een hoek³². De beste resolutie van HPICM-beeldvorming wordt echter bereikt in een omgekeerde microscoopopstelling(Figuur 1A,B),waarbij de beweging van het monster in X-Y-richtingen wordt ontkoppeld van Z-beweging van de nanopipette, waardoor potentiële mechanische artefacten worden geëlimineerd.

Met behulp van HPICM verkregen we topografische beelden van muis en rat binnen- en buitenste haarcel stereocilia bundels, en visualiseerden zelfs de verbindingen tussen de stereocilia die ongeveer 5 nm in diameter^26,27zijn. Het succes van beeldvorming van haarcellenbundels met deze techniek is afhankelijk van verschillende factoren. Ten eerste moet de ruis (variantie) van de nanopipettestroom zo klein mogelijk zijn om het laagst mogelijke instelpunt voor HPICM-beeldvorming mogelijk te maken. Een laag instelpunt stelt HPICM-sonde in staat om het stereocilia-oppervlak op een grotere afstand en onder elke hoek ten opzichte van de sondebenadering te “detecteren” en verbetert verrassend genoeg de X-Y-resolutie van HPICM-beeldvorming (zie discussie). Ten tweede moeten de trillingen en driften in het systeem worden verminderd tot minder dan 10 nm, omdat ze direct bijdragen aan de beeldvormingsartefacten. Ten slotte, hoewel de HPICM-sonde en de monstertrap in Z- en X-Y-assen worden verplaatst door de gekalibreerde feedbackgestuurde piëzo-actuatoren met een nauwkeurigheid van een enkele nanometer of beter, bepaalt de diameter van de nanopipettepunt de spreiding van de stroom (detectievolume) en dus de resolutie(figuur 1A). Daarom is het van vitaal belang om, voordat u levende haarcellen in beeld brengt, de juiste pipetten te trekken, de gewenste resolutie te bereiken met kalibratiemonsters en een laag geluidsniveau in het opnamesysteem te bereiken.

Al minstens een paar decennia is de SICM-techniek niet commercieel beschikbaar en is deze door slechts enkele laboratoria ter wereld ontwikkeld met het toonaangevende laboratorium van Prof. Korchev in het Imperial College (VK). Onlangs zijn verschillende SICM-systemen commercieel beschikbaar geworden (zie Tabel met materialen),die allemaal zijn gebaseerd op de oorspronkelijke HPICM-principes. Het afbeelden van stereociliabundels in de haarcellen vereist echter verschillende aangepaste aanpassingen die technisch uitdagend (of zelfs onmogelijk) zijn in de gesloten “ready-to-go” -systemen. Daarom is enige componentintegratie nodig. Aangezien HPICM-opstelling een patchkleminstallatie vertegenwoordigt met strengere trillings- en driftvereisten en een piëzo-aangedreven beweging van de HPICM-sonde en het monster(figuur 1D),is deze integratie relatief eenvoudig voor elke onderzoeker, die bekwaam is in patchklemmen. Een wetenschapper zonder de juiste achtergrond zou echter zeker eerst enige training in elektrofysiologie nodig hebben. Ondanks resterende uitdagingen zoals het verhogen van de snelheid van beeldvorming (zie Discussie),zijn we in staat geweest om stereocilia-bundels in levende haarcellen met nanoschaalresolutie in beeld te brengen zonder ze te beschadigen.

Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol om succesvolle HPICM-beeldvorming uit te voeren van de levende auditieve haarcelbundels in jonge postnatale rat- of muiscochleaire explantaten met behulp van ons aangepaste systeem. De geïntegreerde componenten zijn opgenomen in de tabel met materialen. Het artikel beschrijft ook veelvoorkomende problemen die kunnen worden ondervonden en hoe u deze kunt oplossen.