Canlı Memeli İşitsel Saç Hücrelerinde Nano ölçekli Çözünürlüğe Sahip Stereosilia Bundle Görüntüleme

İşitsel saç hücrelerindeki stereosilia demetlerinin optik mikroskopi ile görselleştirilecek kadar büyük olmasına ve bir yama kelepçesi deneyinde canlı hücrelerde saptırılmasına rağmen, uç bağlantıları gibi transdüksiyon makinelerinin temel yapısal bileşenleri sadece ölü hücrelerdeki elektron mikroskopisi ile görüntülenebilir. Memeli işitsel saç hücrelerinde, transdüksiyon makineleri uç bağlantılarının alt uçlarında, yani daha kısa sıra stereosili^1’in uçlarında bulunur ve stereosilia^2,3’ünuçlarındaki sinyal yoluyla yerel olarak düzenlenir. Ancak stereosilinin küçük boyutları nedeniyle bu konumdaki yüzey yapılarının canlı saç hücrelerinde etiketsiz görüntülenmesi mümkün değildir.

Memeli koklea iki tür işitsel duyusal hücreye sahiptir: iç ve dış saç hücreleri. İç saç hücrelerinde, stereosili dış saç hücrelerindekilere kıyasla daha uzun ve kalındır⁴. Stereosilinin birinci ve ikinci sırası fare veya sıçan iç saç hücrelerinde 300-500 nm çapındadır. Işığın kırınımı nedeniyle, etiketsiz optik mikroskopi ile elde edilebilen maksimum çözünürlük yaklaşık 200 nm’dir. Bu nedenle, iç saç hücresi demetinin birinci ve ikinci sıraları içindeki bireysel stereosililerin görselleştirilmesi optik mikroskopi ile nispeten kolaydır. Buna karşılık, iç saç hücrelerinde daha kısa sıra stereosili ve dış saç hücrelerinin tüm stereosilileri 100-200 nm civarında çaplara sahiptir ve optik mikroskopi ile görselleştirilemez⁵. Süper çözünürlüklü görüntülemedeki son gelişmelere rağmen, bu temel sınırlama herhangi bir optik etiketsiz görüntülemede devam eder. Mevcut tüm ticari süper çözünürlük teknikleri bir tür floresan molekül gerektirir⁶, uygulamalarını sınırlar. Belirli floresan etiketli moleküllere duyulan ihtiyaç nedeniyle sınırlamalara ek olarak, yoğun ışık ışınlanmasına maruz kalmanın hücresel hasara neden olduğu ve hücresel süreçleri etkileyebileceği gösterilmiştir, bu da canlı hücreleri incelerken büyük bir dezavantajdır⁷.

Saç hücresi stereosilia demetlerinin ultrayapısal detayları hakkındaki güncel bilgimiz çoğunlukla çeşitli elektron mikroskopisi (EM) teknikleri ile elde edilmiştir, taramalı elektron mikroskopisi (SEM), iletim elektron mikroskopisi (TEM), donma-kırılma EM ve son zamanlarda odaklanmış iyon ışını veya kriyo-EM tomografisi ile seri kesitleme gibi 3D tekniklerle 8^{,9,10,11,12,13, 14,15,16}. Ne yazık ki, tüm bu EM teknikleri numunenin kimyasal veya kriyofixasyonunu gerektirir. Fenomenin zaman ölçeğine bağlı olarak, bu gereksinim stereosilianın uçlarındaki dinamik süreçlerin incelenmesini imkansız veya çok emek yoğun hale getirir.

Atomik kuvvet mikroskopisi (AFM)^17,18ile canlı saç hücrelerinin saç demetlerini görüntüleyemek için sınırlı çaba sarf edilmiştir. AFM fizyolojik çözümlerle çalıştığından, teoride, zaman içinde canlı saç hücrelerinin stereosilia demetlerindeki dinamik değişiklikleri görselleştirebilir. Sorun, AFM probu ile numune arasında belirli fiziksel teması ima eden yüksek çözünürlüklü AFM ilkelerinde yatmaktadır, hatta en az zarar veren “dokunma” modunda¹⁹. AFM probu bir stereosiyumla karşılaştığında, genellikle ona çarpar ve saç demetinin yapısına zarar verir. Sonuç olarak, bu teknik canlı, hatta sabit saç hücreleri demetlerini görselleştirmek için uygun değildir^17,18. Numunenin yüzeyine sadece hidrodinamik kuvvetler uygulayan büyük bir top şeklindeki AFM probu kullanılarak sorun kısmen hafifletilebilir²⁰. Bununla birlikte, böyle bir prob numune^21’inmekanik özelliklerini test etmek için ideal olsa da, Corti^22’nin organını görüntülerken sadece bir mikrometre altı çözünürlük sağlar ve yine de numune için son derece hassas stereosilia demetleri için önemli olabilecek bir kuvvet uygular.

Taramalı iyon iletim mikroskopisi (SICM), iletken bir çözelti²³ile doldurulmuş bir cam pipet probu kullanan tarama probu mikroskopisinin bir sürümüdür. SICM, pipet hücreye yaklaştığında yüzeyi algılar ve pipetten geçen elektrik akımı azalır. Bu hücreye dokunmadan önce iyi gerçekleştiğinden, SICM fizyolojik çözelti^24’tecanlı hücrelerin temassız görüntülenmesi için idealdir. SICM’nin en iyi çözünürlüğü, canlı bir hücrenin plazma zarında bireysel protein komplekslerinin çözülmesini sağlayan tek nanometreler sırasına^{göredir 25}. Bununla birlikte, diğer tarama prob tekniklerine benzer şekilde, SICM yalnızca nispeten düz yüzeyleri görüntüleyebilmektedir. Nanopipette’in her görüntüleme noktasında numuneye yaklaştığı atlamalı prob iyon iletkenlik mikroskobu (HPICM)²⁶icat ederek bu sınırlamanın aşısını aştık (Şekil 1A). HPICM kullanarak, stereosilia demetlerini nano ölçekli çözünürlük²⁷ile canlı işitsel saç hücrelerinde görüntüleyebildik.

Bu tekniğin bir diğer temel avantajı, HPICM’nin sadece bir görüntüleme aracı olmamasıdır. Diğer tarama prob tekniklerinin aksine, HPICM/SICM probu, elektrik kayıtları ve çeşitli uyaranların yerel teslimatı için hücre fizyolojisinde yaygın olarak kullanılan bir elektrotdur. İyon kanalı etkinliği genellikle HPICM görüntülemesini engellemez, çünkü HPICM probu aracılığıyla toplam akım, en büyük iyon kanalları²⁵tarafından oluşturulan hücre dışı akımdan daha büyük birkaç büyüklük sırasıdır. Bununla birlikte, HPICM nanopipette’in ilgi çekici bir yapı üzerinde hassas bir şekilde konumlandırılmasına ve daha sonra bu yapıdan tek kanallı yama kelepçesi kaydına izin verir²⁸. Dış saç hücresi stereosili^29’unuçlarında tek kanallı aktivitenin ilk ön kayıtlarını bu şekilde elde ettik. Nanopipetten geçen büyük bir akımın bile, hücre dışı ortamın muazzam elektriksel şantları nedeniyle plazma zarı boyunca potansiyelde önemli değişiklikler üretemeyeceğini belirtmek gerekir. Bununla birlikte, bireysel iyon kanalları nanopipette^30’dan sıvı akışı veya bir agonist^31’inlokal uygulaması ile kimyasal olarak mekanik olarak aktive edilebilir.

HPICM’de görüntü, bir nanopipette bir noktada örneğe ardışık olarak yaklaştığında, geri çekildiğinde ve yaklaşımı tekrarlamak için yanal yönde hareket ettiğinde oluşturulur (Şekil 1A). Bir yama kelepçesi amplifikatörü, banyo çözeltisinde~1 nAakımı oluşturmak için pipetteki bir AgCl teline ( Şekil 1B ) sürekli voltaj uygular. Pipet hücre yüzeyinden uzaktayken bu akımın değeri referans akım olarak belirlenir (I_ref, Şekil 1C). Daha sonra pipet, akım kullanıcı (setpoint) tarafından önceden tanımlanmış bir miktar azaltılana kadar örneğe yaklaşmak için Z ekseninde hareket eder, genellikle I hakeminin% 0.2-1’i (Şekil 1C, üst iz). Sistem daha sonra bu görüntüleme noktasının X ve Y koordinatlarıyla birlikte numunenin yüksekliği olarak şu anda Z değerini kaydeder. Daha sonra pipet, genellikle 700-900 nm/ms olmak üzere kullanıcı tarafından tanımlanan bir hızda yüzeyden(Şekil 1C, alt iz) geri çekilir. Geri çekildikten sonra, pipet (veya bizim durumumuzda örnek – bkz. Şekil 1B)yanal olarak bir sonraki görüntüleme noktasına taşınır, yeni bir referans akım değeri elde edilir ve pipet bir kez daha numuneye yaklaşır ve işlemi tekrarlar. Pipet X-Y hareketi, tipik olarak saç hücresi mekanotransdüksiyon akımlarının kayıtları için kullanılan dik bir mikroskop kurulumunda tercih edilir. Bu ayarda, HPICM probu saç hücresi demetlerine yukarıdan değil,³²açıyla yaklaşır. Bununla birlikte, HPICM görüntülemenin en iyi çözünürlüğü, numunenin X-Y yönlerinde hareketinin nanopipette’in Z hareketinden birleştiği ve böylece potansiyel mekanik eserlerin ortadan kaldırıldığı ters bir mikroskop kurulumunda (Şekil 1A, B) elde edilir.

HPICM kullanarak, fare ve sıçan iç ve dış saç hücresi stereosilia demetlerinin topografik görüntülerini elde ettik ve hatta stereosili arasındaki yaklaşık 5 nm çapında^26,27olan bağlantıları görselleştirdik. Bu teknikle saç hücresi demeti görüntülemenin başarısı çeşitli faktörlere dayanır. İlk olarak, nanopipette akımının gürültüsü (varyansı), HPICM görüntüleme için mümkün olan en düşük setpoint’e izin vermek için mümkün olduğunca küçük olmalıdır. Düşük bir setpoint, HPICM probunun stereosilia yüzeyini daha büyük bir mesafede ve prob yaklaşımına herhangi bir açıda “hissetmesini” sağlar ve şaşırtıcı bir şekilde HPICM görüntülemenin X-Y çözünürlüğünü iyileştirir (bkz. Tartışma). İkincisi, sistemdeki titreşimler ve sürüklenmeler 10 nm’nin altına düşürilmelidir, çünkü görüntüleme eserlerine doğrudan katkıda bulunurlar. Son olarak, HPICM probu ve numune aşaması, tek bir nanometre veya daha iyi bir hassasiyete sahip kalibre edilmiş geri bildirim kontrollü piezo aktüatörleri tarafından Z ve X-Y eksenlerinde hareket ettirilse de, nanopipette ucunun çapı akımın yayılmasını (algılama hacmi) ve dolayısıyla çözünürlüğü belirler (Şekil 1A). Bu nedenle, canlı saç hücrelerini görüntülemeden önce, yeterli pipetlerin çekilmesi, kalibrasyon örnekleri ile istenen çözünürlüğe ulaşılması ve kayıt sisteminde düşük gürültü elde edilmesi hayati önem taşır.

En az birkaç on yıldır, SICM tekniği ticari olarak mevcut değildir ve Imperial College’daki (İngiltere) Prof. Korchev’in önde gelen laboratuvarı ile dünyada sadece birkaç laboratuvar tarafından geliştirilmektedir. Son zamanlarda, hepsi orijinal HPICM ilkelerine dayanan çeşitli SICM sistemleri ticari olarak kullanılabilir hale geldi (bkz. Malzeme Tablosu). Bununla birlikte, saç hücrelerindeki stereosilia demetlerini görüntüleme, kapalı “kullanıma hazır” sistemlerde teknik olarak zorlayıcı (hatta imkansız) birkaç özel değişiklik gerektirir. Bu nedenle, bazı bileşen tümleştirmesi gereklidir. HPICM kurulumu, daha sıkı titreşim ve sürüklenme gereksinimlerine ve HPICM probunun ve numunenin piezo güdümlü hareketine sahip bir yama kelepçe makinesini temsil ettiği için (Şekil 1D), bu entegrasyon yama sıkıştırma konusunda yetkin olan herhangi bir araştırmacı için nispeten kolaydır. Bununla birlikte, uygun bir geçmişi olmayan bir bilim adamının kesinlikle önce elektrofizyoloji konusunda eğitime ihtiyacı olacaktır. Görüntüleme hızını artırmak gibi kalan zorluklara rağmen (bkz. Tartışma), canlı saç hücrelerindeki stereosilia demetlerini zarar vermeden nano ölçekli çözünürlükle görüntüleyebildik.

Bu makale, özel sistemimizi kullanarak genç postnatal sıçan veya fare koklear eksplantlarında canlı işitsel saç hücresi demetlerinin başarılı HPICM görüntülemesini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunun. Entegre bileşenler Malzeme Tablosu‘nda listelenmiştir. Makalede ayrıca karşılaşılabilen yaygın sorunlar ve bunların nasıl giderileceği açıklanmaktadır.