Imagerie de faisceaux stéréocilaires avec résolution à l’échelle nanométrique dans des cellules ciliées auditives de mammifères vivants

Malgré le fait que les faisceaux de stéréocils dans les cellules ciliées auditives sont assez grands pour être visualisés par microscopie optique et déviés dans des cellules vivantes dans une expérience de pince à patch, les composants structurels essentiels de la machinerie de transduction tels que les liens de pointe ne pourraient être imagés qu’avec la microscopie électronique dans les cellules mortes. Dans les cellules ciliées auditives des mammifères, la machine de transduction est située aux extrémités inférieures des maillons de la pointe, c’est-à-dire à l’extrémité des stéréocils de la rangée plus courte¹ et régulée localement par la signalisation aux extrémités des stéréocils^2,3. Pourtant, l’imagerie sans étiquette des structures de surface à cet endroit dans les cellules ciliées vivantes n’est pas possible en raison de la petite taille des stéréocils.

La cochlée de mammifère a deux types de cellules sensorielles auditives: les cellules ciliées internes et externes. Dans les cellules ciliées internes, les stéréocils sont plus longs et plus épais que ceux des cellules ciliées externes⁴. La première et la deuxième rangée de stéréocils ont un diamètre de 300 à 500 nm dans les cellules ciliées internes de souris ou de rats. En raison de la diffraction de la lumière, la résolution maximale réalisable avec une microscopie optique sans étiquette est d’environ 200 nm. Par conséquent, la visualisation des stéréocils individuels dans les première et deuxième rangées du faisceau interne de cellules ciliées est relativement facile avec la microscopie optique. En revanche, les stéréocils de rangée plus courte dans les cellules ciliées internes et tous les stéréocils des cellules ciliées externes ont des diamètres d’environ 100-200 nm et ne peuvent pas être visualisés avec la microscopie optique⁵. Malgré les progrès récents de l’imagerie à super-résolution, cette limitation fondamentale persiste dans toute imagerie optique sans étiquette. Toutes les techniques de super-résolution actuellement disponibles dans le commerce nécessitent une sorte de molécules fluorescentes⁶, ce qui limite leurs applications. En plus des limitations dues à la nécessité de molécules spécifiques marquées par fluorescence, il a été démontré que l’exposition à une irradiation lumineuse intense induit des dommages cellulaires et pourrait influencer les processus cellulaires, ce qui est un grand inconvénient lors de l’étude des cellules vivantes⁷.

Notre connaissance actuelle des détails ultrastructuraux des faisceaux stéréocils des cellules ciliées a été obtenue principalement avec diverses techniques de microscopie électronique (EM), telles que la microscopie électronique à balayage (MEB), la microscopie électronique à transmission (TEM), l’EM par congélation-fracture, et récemment avec des techniques 3D telles que la section en série avec faisceau d’ions focalisés ou la cryo-TOMOGRAPHIE EM⁸,^9,10^{,11,12,13, 14,15,16}. Malheureusement, toutes ces techniques EM nécessitent une fixation chimique ou cryofixation de l’échantillon. Selon l’échelle de temps des phénomènes, cette exigence rend impossible ou très laborieuse l’étude des processus dynamiques aux extrémités des stéréocils.

Des efforts limités ont été faits pour imager des faisceaux de cheveux de cellules ciliées vivantes avec la microscopie à force atomique (AFM)^17,18. Étant donné que l’AFM fonctionne dans des solutions physiologiques, il pourrait, en théorie, visualiser les changements dynamiques dans les faisceaux stéréocilaires des cellules ciliées vivantes au fil du temps. Le problème réside dans les principes de l’AFM haute résolution, qui implique un certain contact physique entre la sonde AFM et l’échantillon, même en mode « tapping » le moins dommageable¹⁹. Lorsque la sonde AFM rencontre un stéréocilium, elle s’écrase généralement contre lui, endommageant la structure du faisceau de cheveux. En conséquence, cette technique ne convient pas à la visualisation de faisceaux de cellules ciliées vivantes, voire fixes,^17,18. Le problème peut être partiellement atténué en utilisant une grande sonde AFM en forme de boule qui n’impose que des forces hydrodynamiques à la surface de l’échantillon²⁰. Cependant, même si une telle sonde est idéale pour tester les propriétés mécaniques de l’échantillon^21,elle ne fournit qu’une résolution inférieure au micromètre lors de l’imagerie de l’organe de Corti²² et applique toujours à l’échantillon une force qui peut être substantielle pour les faisceaux stéréocilaires très sensibles.

La microscopie à conductance ionique à balayage (SICM) est une version de la microscopie à sonde à balayage qui utilise une sonde à pipette en verre remplie d’une solution conductrice²³. SICM détecte la surface lorsque la pipette s’approche de la cellule et que le courant électrique à travers la pipette diminue. Comme cela se produit bien avant de toucher la cellule, le SICM est idéal pour l’imagerie sans contact de cellules vivantes en solution physiologique²⁴. La meilleure résolution du SICM est de l’ordre de nanomètres simples, ce qui permet de résoudre des complexes protéiques individuels au niveau de la membrane plasmique d’une cellule vivante²⁵. Cependant, à l’instar d’autres techniques de sonde de balayage, siCM est capable d’imager uniquement des surfaces relativement planes. Nous avons surmonté cette limitation en inventant le microscope à conductance ionique à sonde sautillante (HPICM)²⁶, dans lequel la nanopipette s’approche de l’échantillon à chaque point d’imagerie(Figure 1A). En utilisant HPICM, nous avons pu imager des faisceaux de stéréocils dans des cellules ciliées auditives vivantes avec une résolution à l’échelle nanométrique²⁷.

Un autre avantage fondamental de cette technique est que HPICM n’est pas seulement un outil d’imagerie. Contrairement à d’autres techniques de sonde à balayage, la sonde HPICM/SICM est une électrode largement utilisée en physiologie cellulaire pour les enregistrements électriques et la livraison locale de divers stimuli. L’activité des canaux ioniques n’interfère généralement pas avec l’imagerie HPICM, car le courant total à travers la sonde HPICM est de plusieurs ordres de grandeur supérieur au courant extracellulaire généré par les plus grands canaux ioniques²⁵. Cependant, HPICM permet un positionnement précis de la nanopipette sur une structure d’intérêt et un enregistrement ultérieur à patch-pince monocanal à partir de cette structure²⁸. C’est ainsi que nous avons obtenu les premiers enregistrements préliminaires de l’activité monocanal aux extrémités des stéréocils externes des cellules^{ciliées 29.} Il convient de mentionner que même un courant important à travers la nanopipette ne peut pas produire de changements significatifs du potentiel à travers la membrane plasmique en raison de l’énorme shunt électrique du milieu extracellulaire. Cependant, les canaux ioniques individuels peuvent être activés mécaniquement par écoulement de liquide à travers la nanopipette³⁰ ou chimiquement par application locale d’un agoniste³¹.

Dans HPICM, l’image est générée lorsqu’une nanopipette s’approche séquentiellement de l’échantillon en un point, se rétracte, puis se déplace dans la direction latérale pour répéter l’approche(Figure 1A). Un amplificateur à pince de raccordement applique constamment une tension à un fil AgCl dans la pipette(Figure 1B)pour générer un courant d’environ 1 nA dans la solution de bain. La valeur de ce courant lorsque la pipette est éloignée de la surface de la cellule est déterminée comme un courant de référence (I_réf, Figure 1C). Ensuite, la pipette se déplace dans l’axe Z pour s’approcher de l’échantillon jusqu’à ce que le courant soit réduit d’une quantité prédéfinie par l’utilisateur (point de consigne), généralement 0,2%-1% de la _référence I (Figure 1C,trace supérieure). Le système enregistre ensuite la valeur Z à ce moment comme la hauteur de l’échantillon, ainsi que les coordonnées X et Y de ce point d’imagerie. Ensuite, la pipette est rétractée loin de la surface(Figure 1C,trace inférieure) à une vitesse définie par l’utilisateur, généralement de 700 à 900 nm/ms. Après la rétraction, la pipette (ou, dans notre cas, l’échantillon – voir figure 1B) est déplacée latéralement vers le point d’imagerie suivant, une nouvelle valeur de courant de référence est obtenue et la pipette s’approche à nouveau de l’échantillon, répétant le processus. Le mouvement X-Y de la pipette est préféré dans une configuration de microscope vertical qui est généralement utilisée pour les enregistrements des courants de mécanotransduction des cellules ciliées. Dans ce contexte, la sonde HPICM s’approche des faisceaux de cellules ciliées non pas par le haut mais à un angle^{de 32}. Cependant, la meilleure résolution de l’imagerie HPICM est obtenue dans une configuration de microscope inversé(Figure 1A,B),où le mouvement de l’échantillon dans les directions X-Y est découplé du mouvement Z de la nanopipette, éliminant ainsi les artefacts mécaniques potentiels.

En utilisant HPICM, nous avons obtenu des images topographiques de faisceaux de stéréocils de cellules ciliées internes et externes de souris et de rats, et avons même visualisé les liens entre les stéréocils d’environ 5 nm de diamètre^26,27. Le succès de l’imagerie des faisceaux de cellules ciliées avec cette technique repose sur plusieurs facteurs. Tout d’abord, le bruit (variance) du courant de la nanopipette doit être aussi faible que possible pour permettre le point de consigne le plus bas possible pour l’imagerie HPICM. Un point de consigne bas permet à la sonde HPICM de « détecter » la surface des stéréocils à une plus grande distance et à n’importe quel angle par rapport à l’approche de la sonde et, étonnamment, améliore la résolution X-Y de l’imagerie HPICM (voir Discussion). Deuxièmement, les vibrations et les dérives dans le système doivent être réduites à moins de 10 nm, car elles contribuent directement aux artefacts d’imagerie. Enfin, même si la sonde HPICM et l’étage de l’échantillon sont déplacés dans les axes Z et X-Y par les actionneurs piézoélectriques calibrés à rétroaction qui ont une précision d’un seul nanomètre ou mieux, le diamètre de la pointe de la nanopipette détermine la propagation du courant (volume de détection) et donc la résolution(Figure 1A). Par conséquent, avant d’imager des cellules ciliées vivantes, il est essentiel de tirer les pipettes adéquates, d’atteindre la résolution souhaitée avec des échantillons d’étalonnage et d’obtenir un faible bruit dans le système d’enregistrement.

Depuis au moins deux décennies, la technique SICM n’est pas disponible dans le commerce et elle n’a été développée que par quelques laboratoires dans le monde avec le laboratoire leader du professeur Korchev à l’Imperial College (Royaume-Uni). Récemment, plusieurs systèmes SICM sont devenus disponibles dans le commerce (voir Tableau des matériaux),qui sont tous basés sur les principes originaux de l’IAHP. Cependant, l’imagerie des faisceaux de stéréocils dans les cellules ciliées nécessite plusieurs modifications personnalisées qui sont techniquement difficiles (voire impossibles) dans les systèmes fermés « prêts à l’emploi ». Par conséquent, une certaine intégration des composants est nécessaire. Étant donné que la configuration HPICM représente un banc de serrage avec des exigences de vibration et de dérive plus strictes et un mouvement piézo-entraîné de la sonde HPICM et de l’échantillon(Figure 1D), cetteintégration est relativement facile pour tout chercheur, qui maîtrise le serrage de patch. Cependant, un scientifique sans formation appropriée aurait certainement besoin d’une formation en électrophysiologie d’abord. Malgré les défis restants tels que l’augmentation de la vitesse d’imagerie (voir Discussion),nous avons été en mesure d’imager des faisceaux de stéréocils dans des cellules ciliées vivantes avec une résolution à l’échelle nanométrique sans les endommager.

Cet article présente un protocole détaillé pour effectuer avec succès l’imagerie HPICM des faisceaux de cellules ciliées auditives vivantes dans les explants cochléaires de jeunes rats ou souris postnatals à l’aide de notre système personnalisé. Les composants intégrés sont répertoriés dans la table des matériaux. Le document décrit également les problèmes courants qui peuvent être rencontrés et comment les résoudre.