Trennung von Follikulärzellen und Oozyten in Denrogarischen Follikel von Zebrafischen
Summary
Hier stellen wir eine einfache Methode zur Trennung von Follikelzellen und Eizellen in Zebrafisch-Ovarialfollikel vor, die Untersuchungen der Eierstockentwicklung bei Zebrafischen erleichtern.
Abstract
Zebrafische sind zu einem idealen Modell geworden, um die Eierstockentwicklung von Wirbeltieren zu untersuchen. Der Follikel ist die Grundeinheit des Eierstocks, die aus Eizellen und umgebenden Follikelzellen besteht. Es ist wichtig, sowohl Follikelzellen als auch Eizellen für verschiedene Forschungszwecke zu trennen, wie z. B. für die Primärkultur von Follikelzellen, die Analyse der Genexpression, die Oozytenreifung und die In-vitro-Fertilisation usw. Die herkömmliche Methode verwendet Zangen, um beide Fächer zu trennen, was mühsam, zeitaufwändig ist und hohe Schäden an der Eizelle hat. Hier haben wir eine einfache Methode etabliert, um beide Fächer mit einer gezogenen Glaskapillare zu trennen. Unter einem Stereomikroskop können Eizellen und Follikelzellen leicht durch Pipettieren in einer gezogenen feinen Glaskapillare getrennt werden (der Durchmesser hängt vom Follikeldurchmesser ab). Im Vergleich zur herkömmlichen Methode hat diese neue Methode eine hohe Effizienz bei der Trennung von Eizellen und Follikelzellen und hat geringe Schäden an den Eizellen. Noch wichtiger ist, dass diese Methode auf Follikel im Frühstadium angewendet werden kann, auch im Stadium der Prävitellogenese. Somit kann diese einfache Methode verwendet werden, um Follikelzellen und Eizellen von Zebrafischen zu trennen.
Introduction
Zebrafisch ist ein wichtiger Modellorganismus für die Erforschung der Wirbeltierentwicklung und Physiologie. Der Zebrafisch kann als gutes Modell für die Untersuchung der molekularen Mechanismen der Eierstockentwicklungdienen 1,2,3. Viele Merkmale der Eierstockentwicklung sind während der Evolution von Fischen zu Säugetieren sehr erhalten1,2. Ähnlich wie die anderen Wirbeltiere haben Zebrafische Erwachsene asynchrone Eierstöcke, die Eierstockfollikel aller Entwicklungsstadien enthalten4. Der Follikel ist das grundlegende Fortpflanzungselement des Eierstocks. Der Follikel besteht aus der Eizelle, die von einer oder mehreren Schichten somatischer Zellen umgeben ist, die als Follikelzellen bezeichnet werden. Die Entwicklung von Follikel hängt von der bidirektionalen Kommunikation zwischen Eizellen und Follikelzellenab 5. Es ist wichtig, Follikelzellen und Eizellen von Eierstockfollikel für verschiedene Forschungszwecke wie Follikelzellprimärkultur, Genexpressionsanalyse, Eizellenreifung und In-vitro-Fertilisation zu trennen.
Herkömmliche Trennverfahren umfassen die mechanische Trennung durch Zangen und die enzymatische Verdauung6,7,8,9,10. Die mechanische Trennung durch Zangen ist jedoch zeitaufwändig und mühsam. Es wird auch die hohen Schäden an der Oozyte während der Trennung verursachen. Obwohl die Enzymverdauungsmethode einfach zu bedienen ist und eine kurze Zeit erfordert, sollten die Behandlungszeit und die Enzymkonzentration validiert werden, und die Integrität und Überlebensrate der isolierten Eizellen sind nicht ideal. Daher haben wir eine einfache Methode entwickelt, um beide Fächer in verschiedenen Entwicklungsstadien mit gezogenen Glaskapillarrohren zu trennen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beschreiben hier eine neuartige Methode zur einfachen und schnellen Trennung von Follikelzellen und Eizellen von Zebrafisch-Ovarialfollikel. Diese Methode hat gegenüber der herkömmlichen Methode mehrere Vorteile. Dazu gehört vor allem die stark erhöhte Trennungsfreundlichkeit mit hoher Effizienz und Wirksamkeit, da nur eine einzige und externe Manipulation erforderlich ist. Dieser Punkt erhöht die Anwendbarkeit für Forscher, die nicht gut in der mikroskopischen Anatomie sind. Nach unserer Erfahrung kann man Fol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschungsarbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China [32060170, 31601205 und 31560334] unterstützt, einem Gastwissenschaftlerprojekt, das vom China Scholarship Council und dem Fundus des State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology [2020FB05] unterstützt wurde.
Materials
| 17α,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Ampoule cutter | AS ONE | 5-124-22 1 bag (100 pieces) | |
| Anhydrous Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Brine shrimp | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Culture dish | Biosharp | BS-90-D (10PCS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Dissecting Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Dissection forcep | VETUS | HRC30 | |
| Dissection scissor | Kefu | 160 mm | |
| Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M205C | |
| Glass capillary | IWAKI | IK-PAS-5P (200 pcs/PACK) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Micropipette tips | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscope | ZEISS | Discover.v20 |
References
- Clelland, E., Peng, C. Endocrine/paracrine control of zebrafish development. Molecular and Cellular Endocrinology. 312, 42-52 (2009).
- Ge, W. Intrafollicular paracrine communication in the zebrafish ovary: the state of the art of an emerging model for the study of vertebrate folliculogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 237, 1-10 (2005).
- Li, J., Ge, W. Zebrafish as a model for studying ovarian development: Recent advances from targeted gene knockout studies. Molecular and Cellular Endocrinology. 507, 1-19 (2020).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. Journal of Morphology. 218, 203-224 (1993).
- Matzuk, M. M., Burns, K. H., Viveiros, M. M., Eppig, J. J. Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation. Science. 296, 2178-2180 (2002).
- Liu, L., Ge, W. Growth differentiation factor 9 and its spatiotemporal expression and regulation in the zebrafish ovary. Biology of Reproduction. 76, 294-302 (2007).
- Zhou, R., Tsang, A. H., Lau, S. W., Ge, W. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the zebrafish ovary: evidence for potentially dual roles of PACAP in controlling final oocyte maturation. Biology of Reproduction. 85, 615-625 (2011).
- Li, J., Liu, Z., Wang, D., Cheng, C. H. K. Insulin-like growth factor 3 is involved in oocyte maturation in zebrafish. Biology of Reproduction. 84, 476-486 (2011).
- Pang, Y., Thomas, P. Role of G protein-coupled estrogen receptor 1, GPER, in inhibition of oocyte maturation by endogenous estrogens in zebrafish. Developmental Biology. 342, 194-206 (2010).
- Peyton, C., Thomas, P. Involvement of epidermal growth factor receptor signaling in estrogen inhibition of oocyte maturation mediated through the G protein-coupled estrogen receptor (Gper) in zebrafish (Danio rerio). Biology of Reproduction. 85, 42-50 (2011).
- Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., F, P. Functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (122), e55213 (2017).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics. 242, 44-52 (2013).
- Seki, S., et al. Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes. Reproduction. 135, 285-292 (2008).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments. , e54492 (2016).
- Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Scientific Reports. 6, 34555 (2016).
- Li, J., Bai, L., Liu, Z., Wang, W. Dual roles of PDE9a in meiotic maturation of zebrafish oocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2020).
