Zebra Balıklarının Yumurtalık Foliküllerinde Foliküler Hücrelerin ve Oositlerin Ayrılması
Summary
Burada, zebra balığında yumurtalık gelişiminin araştırılmasını kolaylaştıracak zebra balığı yumurtalık foliküllerindeki foliküler hücreleri ve oositleri ayırmak için basit bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Zebra balığı omurgalıların yumurtalık gelişimini incelemek için ideal bir model haline gelmiştir. Folikül, oositler ve çevresindeki foliküler hücrelerden oluşan yumurtalığın temel birimidir. Foliküler hücrelerin birincil kültürü, gen ekspresyonunun analizi, oosit olgunlaşması ve in vitro fertilizasyon vb. Geleneksel yöntem, zahmetli, zaman alıcı ve oositte yüksek hasara sahip olan her iki bölmeyi ayırmak için önseçim kullanır. Burada, çekilmiş bir cam kılcal damar kullanarak her iki bölmeyi ayırmak için basit bir yöntem belirledik. Stereomikroskop altında, oositler ve foliküler hücreler çekilmiş ince cam kılcal damarda pipetleme ile kolayca ayrılabilir (çap folikül çapına bağlıdır). Geleneksel yöntemle karşılaştırıldığında, bu yeni yöntem hem oositleri hem de foliküler hücreleri ayırmada yüksek verimliliğe sahiptir ve oositlere düşük hasara sahiptir. Daha da önemlisi, bu yöntem pre-vitellogenez aşamasında da dahil olmak üzere erken evre foliküllere uygulanabilir. Böylece, bu basit yöntem foliküler hücreleri ve zebra balığı oositlerini ayırmak için kullanılabilir.
Introduction
Zebra balığı omurgalı gelişimi ve fizyolojisi çalışması için önemli bir model organizmadır. Zebra balığı, yumurtalık gelişiminin moleküler mekanizmalarını incelemek için iyi bir model olarak hizmet edebilir1,2,3. Yumurtalık gelişiminin birçok özelliği, balıklardan memelilere evrim sırasında çok korunur1,2. Diğer omurgalılara benzer şekilde, zebra balığı yetişkinleri, tüm gelişim evrelerindeki yumurtalık köklerini içeren asenkron yumurtalıklara sahiptir4. Folikül yumurtalığın temel üreme elemanıdır. Folikül, foliküler hücre adı verilen bir veya birkaç somatik hücre katmanı ile çevrili oositten oluşur. Foliküllerin gelişimi, oositler ve foliküler hücreler arasındaki çift yönlü iletişime bağlıdır5. Foliküler hücre birincil kültürü, gen ekspresyon analizi, oosit olgunlaşması ve in vitro fertilizasyon gibi farklı araştırma amaçları için foliküler hücrelerin ve oositlerin yumurtalık foliküllerinden ayrılması hayati önem taşımaktadır.
Geleneksel ayırma yöntemleri arasında mekanik olarak emişlere göre ayırma ve enzymatic sindirim6,7,8,9,10 bulunur. Bununla birlikte, mekanik ayırma, zaman alıcı ve zahmetlidir. Ayrıca ayırma sırasında oositte yüksek hasara neden olacaktır. Enzim sindirim yönteminin kullanımı basit olmasına ve kısa bir süre gerektirmesine rağmen, tedavi süresi ve enzim konsantrasyonu doğrulanmalıdır ve izole edilen oositlerin bütünlüğü ve hayatta kalma oranı ideal değildir. Bu nedenle, çekilen cam kılcal borular kullanarak her iki bölmeyi de farklı gelişim aşamalarında ayırmak için basit bir yöntem oluşturduk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada foliküler hücrelerin ve oositlerin zebra balığı yumurtalık foliküllerinden basit ve hızlı bir şekilde ayrılması için yeni bir yöntem tarif ediyoruz. Bu yöntemin geleneksel yönteme göre çeşitli avantajları vardır. Bunlar arasında birincil olan, sadece tek ve harici bir manipülasyon gerektiğinden, yüksek verimlilik ve etkinlikle büyük ölçüde artan ayırma kolaylığıdır. Bu nokta mikroskobik anatomide iyi olmayan araştırmacılara uygulanabilirliği arttırır. Deneyimlerimize göre,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı [32060170, 31601205 ve 31560334], Çin Burs Konseyi ve Tatlı Su Ekolojisi ve BiyoteknolojiSi Devlet Anahtar Laboratuvarı fonu tarafından desteklenen misafir bilim adamı projesi [2020FB05] tarafından desteklendi.
Materials
| 17α,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Ampoule cutter | AS ONE | 5-124-22 1 bag (100 pieces) | |
| Anhydrous Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Brine shrimp | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Culture dish | Biosharp | BS-90-D (10PCS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Dissecting Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Dissection forcep | VETUS | HRC30 | |
| Dissection scissor | Kefu | 160 mm | |
| Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M205C | |
| Glass capillary | IWAKI | IK-PAS-5P (200 pcs/PACK) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Micropipette tips | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscope | ZEISS | Discover.v20 |
References
- Clelland, E., Peng, C. Endocrine/paracrine control of zebrafish development. Molecular and Cellular Endocrinology. 312, 42-52 (2009).
- Ge, W. Intrafollicular paracrine communication in the zebrafish ovary: the state of the art of an emerging model for the study of vertebrate folliculogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 237, 1-10 (2005).
- Li, J., Ge, W. Zebrafish as a model for studying ovarian development: Recent advances from targeted gene knockout studies. Molecular and Cellular Endocrinology. 507, 1-19 (2020).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. Journal of Morphology. 218, 203-224 (1993).
- Matzuk, M. M., Burns, K. H., Viveiros, M. M., Eppig, J. J. Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation. Science. 296, 2178-2180 (2002).
- Liu, L., Ge, W. Growth differentiation factor 9 and its spatiotemporal expression and regulation in the zebrafish ovary. Biology of Reproduction. 76, 294-302 (2007).
- Zhou, R., Tsang, A. H., Lau, S. W., Ge, W. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the zebrafish ovary: evidence for potentially dual roles of PACAP in controlling final oocyte maturation. Biology of Reproduction. 85, 615-625 (2011).
- Li, J., Liu, Z., Wang, D., Cheng, C. H. K. Insulin-like growth factor 3 is involved in oocyte maturation in zebrafish. Biology of Reproduction. 84, 476-486 (2011).
- Pang, Y., Thomas, P. Role of G protein-coupled estrogen receptor 1, GPER, in inhibition of oocyte maturation by endogenous estrogens in zebrafish. Developmental Biology. 342, 194-206 (2010).
- Peyton, C., Thomas, P. Involvement of epidermal growth factor receptor signaling in estrogen inhibition of oocyte maturation mediated through the G protein-coupled estrogen receptor (Gper) in zebrafish (Danio rerio). Biology of Reproduction. 85, 42-50 (2011).
- Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., F, P. Functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (122), e55213 (2017).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics. 242, 44-52 (2013).
- Seki, S., et al. Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes. Reproduction. 135, 285-292 (2008).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments. , e54492 (2016).
- Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Scientific Reports. 6, 34555 (2016).
- Li, J., Bai, L., Liu, Z., Wang, W. Dual roles of PDE9a in meiotic maturation of zebrafish oocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2020).
