Разделение фолликулярной клетки и ооцитов в фолликулах яичников зебры
Summary
Здесь мы представляем простой метод разделения фолликулярной клетки и яйцеклетки в фолликулах яичников зебры, что облегчит исследования развития яичников у зебры.
Abstract
Зебрафиш стала идеальной моделью для изучения развития яичников позвоночных. Фолликул является основной единицей яичника, который состоит из яйцеклеток и окружающих фолликулярных клеток. Очень важно отделить фолликулярные клетки и яйцеклетки для различных исследовательских целей, таких как первичная культура фолликулярной клетки, анализ экспрессии генов, созревание яйцеклеток и экстракорпоральное оплодотворение и т.д. Обычный метод использует типсы, чтобы отделить оба отсека, что является трудоемким, трудоемким и имеет высокий урон яйцеклетки. Здесь мы создали простой метод, чтобы отделить оба отсека с помощью вытащил стеклянный капилляр. Под стереомикроскопом, яйцеклетки и фолликулярные клетки могут быть легко разделены трубопроводов в вытащил тонкой стеклянной капиллярной (диаметр зависит от диаметра фолликула). По сравнению с обычным методом, этот новый метод имеет высокую эффективность в разделении обоих яйцеклеток и фолликулярной клетки и имеет низкий ущерб яйцеклеток. Что еще более важно, этот метод может быть применен к фолликулам на ранних стадиях, в том числе на стадии превителлогенеза. Таким образом, этот простой метод может быть использован для отдельных фолликулярных клеток и яйцеклеток зебры.
Introduction
Зебрафиш является основным моделью организма для изучения развития позвоночных и физиологии. Зебрафиш может служить хорошей моделью для изучения молекулярных механизмов развития яичников1,2,3. Многие особенности развития яичников значительно сохранены в процессе эволюции от рыбы кмлекопитающим 1,2. Как и у других позвоночных, у взрослых зебры асинхронные яичники, содержащие фолликулы яичников всех стадий развития4. Фолликул является основным репродуктивным элементом яичника. Фолликул состоит из яйцеклетки, которая окружена одним или несколькими слоями соматических клеток, называемых фолликулярными клетками. Развитие фолликулов зависит от двунаправленной связи между яйцеклетками и фолликулярными клетками5. Очень важно отделить фолликулярные клетки и яйцеклетки от фолликулов яичников для различных исследовательских целей, таких как фолликулярная клеточная первичная культура, анализ экспрессии генов, созревание яйцеклеток и экстракорпоральное оплодотворение.
Традиционные методы разделения включают механическое разделение типсами и энзиматическое пищеварение6,7,8,9,10. Тем не менее, механическое разделение типсами является трудоемким и трудоемким. Это также приведет к высокому повреждению яйцеклетки во время разделения. Хотя метод переваривания ферментов прост в эксплуатации и требует короткого времени, время лечения и концентрация ферментов должны быть проверены, и целостность и выживаемость изолированных яйцеклеток не являются идеальными. Таким образом, мы создали простой метод, чтобы отделить оба отсека на разных стадиях развития с помощью вытащил стеклянные капиллярные трубки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы описываем здесь новый метод для простого и быстрого отделения фолликулярной клетки и яйцеклетки от фолликулов яичников зебры. Этот метод имеет ряд преимуществ по сравнению с обычным методом. Главным из них является значительно возросшей легкостью разделения с высокой эффективност…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта исследовательская работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (32060170, 31601205 и 31560334), посетив научный проект при поддержке Китайского стипендиального совета и фонда Государственной ключевой лаборатории пресноводной экологии и биотехнологии (2020FB05).
Materials
| 17α,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Ampoule cutter | AS ONE | 5-124-22 1 bag (100 pieces) | |
| Anhydrous Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Brine shrimp | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Culture dish | Biosharp | BS-90-D (10PCS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Dissecting Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Dissection forcep | VETUS | HRC30 | |
| Dissection scissor | Kefu | 160 mm | |
| Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M205C | |
| Glass capillary | IWAKI | IK-PAS-5P (200 pcs/PACK) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Micropipette tips | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscope | ZEISS | Discover.v20 |
References
- Clelland, E., Peng, C. Endocrine/paracrine control of zebrafish development. Molecular and Cellular Endocrinology. 312, 42-52 (2009).
- Ge, W. Intrafollicular paracrine communication in the zebrafish ovary: the state of the art of an emerging model for the study of vertebrate folliculogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 237, 1-10 (2005).
- Li, J., Ge, W. Zebrafish as a model for studying ovarian development: Recent advances from targeted gene knockout studies. Molecular and Cellular Endocrinology. 507, 1-19 (2020).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. Journal of Morphology. 218, 203-224 (1993).
- Matzuk, M. M., Burns, K. H., Viveiros, M. M., Eppig, J. J. Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation. Science. 296, 2178-2180 (2002).
- Liu, L., Ge, W. Growth differentiation factor 9 and its spatiotemporal expression and regulation in the zebrafish ovary. Biology of Reproduction. 76, 294-302 (2007).
- Zhou, R., Tsang, A. H., Lau, S. W., Ge, W. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the zebrafish ovary: evidence for potentially dual roles of PACAP in controlling final oocyte maturation. Biology of Reproduction. 85, 615-625 (2011).
- Li, J., Liu, Z., Wang, D., Cheng, C. H. K. Insulin-like growth factor 3 is involved in oocyte maturation in zebrafish. Biology of Reproduction. 84, 476-486 (2011).
- Pang, Y., Thomas, P. Role of G protein-coupled estrogen receptor 1, GPER, in inhibition of oocyte maturation by endogenous estrogens in zebrafish. Developmental Biology. 342, 194-206 (2010).
- Peyton, C., Thomas, P. Involvement of epidermal growth factor receptor signaling in estrogen inhibition of oocyte maturation mediated through the G protein-coupled estrogen receptor (Gper) in zebrafish (Danio rerio). Biology of Reproduction. 85, 42-50 (2011).
- Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., F, P. Functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (122), e55213 (2017).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics. 242, 44-52 (2013).
- Seki, S., et al. Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes. Reproduction. 135, 285-292 (2008).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments. , e54492 (2016).
- Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Scientific Reports. 6, 34555 (2016).
- Li, J., Bai, L., Liu, Z., Wang, W. Dual roles of PDE9a in meiotic maturation of zebrafish oocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2020).
