Separação de células foliculares e oócitos em folículos ovarianos de zebrafish
Summary
Aqui, apresentamos um método simples para separar células foliculares e oócitos em folículos ovarianos de zebrafish, o que facilitará investigações do desenvolvimento ovariano em zebrafish.
Abstract
O zebrafish tornou-se um modelo ideal para estudar o desenvolvimento ovariano de vertebrados. O folículo é a unidade básica do ovário, que consiste em oócitos e células foliculares circundantes. É vital separar células foliculares e oócitos para vários fins de pesquisa, como para a cultura primária das células foliculares, análise da expressão genética, maturação de oócitos e fertilização in vitro, etc. O método convencional usa fórceps para separar ambos os compartimentos, o que é trabalhoso, demorado e tem alto dano ao oócito. Aqui, estabelecemos um método simples para separar ambos os compartimentos usando um capilar de vidro puxado. Sob um estereótipo, oócitos e células foliculares podem ser facilmente separados por tubulação em um capilar de vidro fino puxado (o diâmetro depende do diâmetro do folículo). Comparado com o método convencional, este novo método tem alta eficiência na separação de oócitos e células foliculares e tem baixo dano aos oócitos. Mais importante, este método pode ser aplicado a folículos em estágio inicial, inclusive na fase pré-vitellogênese. Assim, este método simples pode ser usado para separar células foliculares e oócitos de zebrafish.
Introduction
O zebrafish é um dos principais organismos modelo para o estudo do desenvolvimento de vertebrados e fisiologia. O zebrafish pode servir como um bom modelo para estudar os mecanismos moleculares do desenvolvimento ovariano1,2,3. Muitas características do desenvolvimento ovariano são muito conservadas durante a evolução de peixes para mamíferos1,2. Semelhante aos outros vertebrados, os adultos de zebrafish têm ovários assíncronsos, contendo folículos ovarianos de todos os estágios de desenvolvimento4. O folículo é o elemento reprodutivo fundamental do ovário. O folículo consiste no oócito que é cercado por uma ou várias camadas de células somáticas chamadas células foliculares. O desenvolvimento de folículos depende da comunicação bidirecional entre oócitos e células foliculares5. É vital separar células foliculares e oócitos dos folículos ovarianos para diferentes propósitos de pesquisa, como cultura primária de células foliculares, análise de expressão genética, maturação de oócitos e fertilização in vitro.
Os métodos tradicionais de separação incluem separação mecânica por fórceps e digestão enzimática6,7,8,9,10. No entanto, a separação mecânica por fórceps é demorada e trabalhosa. Também causará o alto dano ao oócito durante a separação. Embora o método de digestão da enzima seja simples de operar e exija um curto espaço de tempo, o tempo de tratamento e a concentração enzimática devem ser validados, e a taxa de integridade e sobrevivência dos oócitos isolados não são ideais. Por isso, estabelecemos um método simples para separar ambos os compartimentos em diferentes estágios de desenvolvimento usando tubos capilares de vidro puxados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrevemos aqui um novo método para a simples e rápida separação de células foliculares e oócitos dos folículos ovarianos de zebrafish. Este método tem várias vantagens em relação ao método convencional. Entre elas, a maior facilidade de separação com alta eficiência e eficácia, pois apenas uma única manipulação externa é necessária. Este ponto aumenta a aplicabilidade para pesquisadores que não são bons em anatomia microscópica. De acordo com nossa experiência, pode-se separar com sucesso célu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho de pesquisa foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China [32060170, 31601205 e 31560334], visitando projeto acadêmico apoiado pelo China Scholarship Council e pelo Fundo Estadual de Ecologia e Biotecnologia de Água Doce [2020FB05].
Materials
| 17α,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Ampoule cutter | AS ONE | 5-124-22 1 bag (100 pieces) | |
| Anhydrous Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Brine shrimp | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Culture dish | Biosharp | BS-90-D (10PCS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Dissecting Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Dissection forcep | VETUS | HRC30 | |
| Dissection scissor | Kefu | 160 mm | |
| Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M205C | |
| Glass capillary | IWAKI | IK-PAS-5P (200 pcs/PACK) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Micropipette tips | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscope | ZEISS | Discover.v20 |
References
- Clelland, E., Peng, C. Endocrine/paracrine control of zebrafish development. Molecular and Cellular Endocrinology. 312, 42-52 (2009).
- Ge, W. Intrafollicular paracrine communication in the zebrafish ovary: the state of the art of an emerging model for the study of vertebrate folliculogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 237, 1-10 (2005).
- Li, J., Ge, W. Zebrafish as a model for studying ovarian development: Recent advances from targeted gene knockout studies. Molecular and Cellular Endocrinology. 507, 1-19 (2020).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. Journal of Morphology. 218, 203-224 (1993).
- Matzuk, M. M., Burns, K. H., Viveiros, M. M., Eppig, J. J. Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation. Science. 296, 2178-2180 (2002).
- Liu, L., Ge, W. Growth differentiation factor 9 and its spatiotemporal expression and regulation in the zebrafish ovary. Biology of Reproduction. 76, 294-302 (2007).
- Zhou, R., Tsang, A. H., Lau, S. W., Ge, W. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the zebrafish ovary: evidence for potentially dual roles of PACAP in controlling final oocyte maturation. Biology of Reproduction. 85, 615-625 (2011).
- Li, J., Liu, Z., Wang, D., Cheng, C. H. K. Insulin-like growth factor 3 is involved in oocyte maturation in zebrafish. Biology of Reproduction. 84, 476-486 (2011).
- Pang, Y., Thomas, P. Role of G protein-coupled estrogen receptor 1, GPER, in inhibition of oocyte maturation by endogenous estrogens in zebrafish. Developmental Biology. 342, 194-206 (2010).
- Peyton, C., Thomas, P. Involvement of epidermal growth factor receptor signaling in estrogen inhibition of oocyte maturation mediated through the G protein-coupled estrogen receptor (Gper) in zebrafish (Danio rerio). Biology of Reproduction. 85, 42-50 (2011).
- Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., F, P. Functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (122), e55213 (2017).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics. 242, 44-52 (2013).
- Seki, S., et al. Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes. Reproduction. 135, 285-292 (2008).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments. , e54492 (2016).
- Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Scientific Reports. 6, 34555 (2016).
- Li, J., Bai, L., Liu, Z., Wang, W. Dual roles of PDE9a in meiotic maturation of zebrafish oocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2020).
