Séparation des cellules folliculaires et des ovocytes dans les follicules ovariens du poisson zèbre
Summary
Ici, nous présentons une méthode simple pour séparer les cellules folliculaires et les ovocytes dans les follicules ovariens de poisson zèbre, qui facilitera des investigations du développement ovarien dans le poisson zèbre.
Abstract
Le poisson zèbre est devenu un modèle idéal pour étudier le développement ovarien des vertébrés. Le follicule est l’unité de base de l’ovaire, qui se compose d’ovocytes et de cellules folliculaires environnantes. Il est essentiel de séparer les cellules folliculaires et les ovocytes à diverses fins de recherche, comme pour la culture primaire des cellules folliculaires, l’analyse de l’expression des gènes, la maturation des ovocytes et la fécondation in vitro, etc. La méthode conventionnelle utilise des forceps pour séparer les deux compartiments, ce qui est laborieux, long et a des dommages élevés à l’ovocyte. Ici, nous avons établi une méthode simple pour séparer les deux compartiments à l’aide d’un capillaire en verre tiré. Sous un stéréomicroscope, les ovocytes et les cellules folliculaires peuvent être facilement séparés par pipetting dans un capillaire en verre fin tiré (le diamètre dépend du diamètre du follicule). Par rapport à la méthode conventionnelle, cette nouvelle méthode a une grande efficacité dans la séparation des ovocytes et des cellules folliculaires et a de faibles dommages aux ovocytes. Plus important encore, cette méthode peut être appliquée aux follicules à un stade précoce, y compris au stade de pré-vitellogenèse. Ainsi, cette méthode simple peut être utilisée pour séparer les cellules folliculaires et les ovocytes du poisson zèbre.
Introduction
Le poisson zèbre est un organisme modèle majeur pour l’étude du développement et de la physiologie des vertébrés. Le poisson zèbre peut servir de bon modèle pour étudier les mécanismes moléculaires du développementovarien 1,2,3. De nombreuses caractéristiques du développement ovarien sont beaucoup conservées au cours de l’évolution du poissonaux mammifères 1,2. Comme les autres vertébrés, les adultes zèbres ont des ovaires asynchrones, contenant des follicules ovariens de tous les stadesdéveloppementaux 4. Le follicule est l’élément reproducteur fondamental de l’ovaire. Le follicule se compose de l’ovocyte qui est entouré d’une ou plusieurs couches de cellules somatiques appelées cellules folliculaires. Le développement des follicules dépend de la communication bidirectionnelle entre les ovocytes et les cellules folliculaires5. Il est essentiel de séparer les cellules folliculaires et les ovocytes des follicules ovariens à différentes fins de recherche telles que la culture primaire folliculaire des cellules, l’analyse de l’expression génique, la maturation des ovocytes et la fécondation in vitro.
Les méthodes traditionnelles de séparation comprennent la séparation mécanique par forceps et la digestion enzymatique6,7,8,9,10. Cependant, la séparation mécanique par forceps est longue et laborieuse. Il causera également les dommages élevés à l’ovocyte pendant la séparation. Bien que la méthode de digestion enzymatique soit simple à utiliser et nécessite peu de temps, le temps de traitement et la concentration enzymatique doivent être validés, et le taux d’intégrité et de survie des ovocytes isolés n’est pas idéal. Par conséquent, nous avons établi une méthode simple pour séparer les deux compartiments à différents stades de développement à l’aide de tubes capillaires en verre tiré.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici une nouvelle méthode pour la séparation simple et rapide des cellules folliculaires et des ovocytes des follicules ovariens de zebrafish. Cette méthode présente plusieurs avantages par rapport à la méthode conventionnelle. La principale d’entre elles est la facilité considérablement accrue de séparation avec une efficacité et une efficacité élevées, car seule une manipulation unique et externe est nécessaire. Ce point augmente l’applicabilité pour les chercheurs qui ne sont pas bons…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux de recherche ont été soutenus par la National Natural Science Foundation of China [32060170, 31601205 et 31560334], projet universitaire invité soutenu par le China Scholarship Council et le fonds du State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology [2020FB05].
Materials
| 17α,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Ampoule cutter | AS ONE | 5-124-22 1 bag (100 pieces) | |
| Anhydrous Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Brine shrimp | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Culture dish | Biosharp | BS-90-D (10PCS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Dissecting Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Dissection forcep | VETUS | HRC30 | |
| Dissection scissor | Kefu | 160 mm | |
| Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M205C | |
| Glass capillary | IWAKI | IK-PAS-5P (200 pcs/PACK) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Micropipette tips | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscope | ZEISS | Discover.v20 |
References
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