Scheiding van folliculaire cellen en oöcyten in ovariële follikels van zebravissen
Summary
Hier presenteren we een eenvoudige methode voor het scheiden van folliculaire cellen en oöcyten in eierstokfollikels van zebravissen, wat het onderzoek naar de ontwikkeling van eierstokvissen bij zebravissen zal vergemakkelijken.
Abstract
Zebravissen zijn een ideaal model geworden om de eierstokontwikkeling van gewervelde dieren te bestuderen. De follikel is de basiseenheid van de eierstok, die bestaat uit oöcyten en omliggende folliculaire cellen. Het is van vitaal belang om zowel folliculaire cellen als oöcyten te scheiden voor verschillende onderzoeksdoeleinden, zoals voor primaire cultuur van folliculaire cellen, analyse van genexpressie, oöcytrijping en in-vitrofertilisatie, enz. De conventionele methode gebruikt tangen om beide compartimenten te scheiden, wat arbeidsintensief, tijdrovend en hoge schade aan de oöcyt heeft. Hier hebben we een eenvoudige methode opgezet om beide compartimenten te scheiden met behulp van een getrokken glazen capillair. Onder een stereomicroscoop kunnen oöcyten en folliculaire cellen gemakkelijk worden gescheiden door pipetten in een getrokken fijn glazen capillair (de diameter is afhankelijk van de follikeldiameter). In vergelijking met de conventionele methode heeft deze nieuwe methode een hoog rendement bij het scheiden van zowel oöcyten als folliculaire cellen en heeft het een lage schade aan de oöcyten. Wat nog belangrijker is, deze methode kan worden toegepast op follikels in een vroeg stadium, ook in het stadium vóór vitellogenese. Deze eenvoudige methode kan dus worden gebruikt om folliculaire cellen en oöcyten van zebravissen te scheiden.
Introduction
Zebravis is een belangrijk modelorganisme voor de studie van gewervelde ontwikkeling en fysiologie. De zebravis kan dienen als een goed model voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen van eierstokontwikkeling1,2,3. Veel kenmerken van de ontwikkeling van de eierstok zijn veel behouden tijdens de evolutie van vis naar zoogdieren1,2. Net als de andere gewervelde dieren hebben zebravisvolwassenen asynchrone eierstokken, die ovariële follikels van alle ontwikkelingsstadia bevatten4. De follikel is het fundamentele reproductieve element van de eierstok. De follikel bestaat uit de oöcyt die wordt omgeven door een of meerdere lagen somatische cellen die folliculaire cellen worden genoemd. De ontwikkeling van follikels hangt af van de bidirectionele communicatie tussen oöcyten en folliculaire cellen5. Het is van vitaal belang om folliculaire cellen en oöcytcellen van ovariële follikels te scheiden voor verschillende onderzoeksdoeleinden, zoals folliculaire cel primaire cultuur, genexpressieanalyse, oöcytrijping en in-vitrofertilisatie.
Traditionele scheidingsmethoden omvatten mechanische scheiding door tang en enzymatische vergisting6,7,8,9,10. De mechanische scheiding door een tang is echter tijdrovend en arbeidsintensief. Het zal ook de hoge schade aan de oöcyt veroorzaken tijdens de scheiding. Hoewel de enzymverteringsmethode eenvoudig te bedienen is en een korte tijd vereist, moeten de behandelingstijd en enzymconcentratie worden gevalideerd en zijn de integriteit en overlevingskans van de geïsoleerde oöcyten niet ideaal. Daarom hebben we een eenvoudige methode opgezet om beide compartimenten in verschillende ontwikkelingsstadia te scheiden met behulp van getrokken glazen capillaire buizen.
Protocol
Representative Results
Discussion
We beschrijven hier een nieuwe methode voor de eenvoudige en snelle scheiding van folliculaire cellen en oöcyten van eierstokfollikels van zebravissen. Deze methode heeft verschillende voordelen ten opzichte van de conventionele methode. Primair is het sterk toegenomen scheidingsgemak met hoge efficiëntie en effectiviteit, omdat slechts één enkele en externe manipulatie vereist is. Dit punt verhoogt de toepasbaarheid voor onderzoekers die niet goed zijn in microscopische anatomie. Volgens onze ervaring kan men follic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoekswerk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China [32060170, 31601205 en 31560334], visiting scholar project ondersteund door China Scholarship Council en het fonds van State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology [2020FB05].
Materials
| 17α,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Ampoule cutter | AS ONE | 5-124-22 1 bag (100 pieces) | |
| Anhydrous Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Brine shrimp | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Culture dish | Biosharp | BS-90-D (10PCS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Dissecting Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Dissection forcep | VETUS | HRC30 | |
| Dissection scissor | Kefu | 160 mm | |
| Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M205C | |
| Glass capillary | IWAKI | IK-PAS-5P (200 pcs/PACK) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Micropipette tips | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscope | ZEISS | Discover.v20 |
References
- Clelland, E., Peng, C. Endocrine/paracrine control of zebrafish development. Molecular and Cellular Endocrinology. 312, 42-52 (2009).
- Ge, W. Intrafollicular paracrine communication in the zebrafish ovary: the state of the art of an emerging model for the study of vertebrate folliculogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 237, 1-10 (2005).
- Li, J., Ge, W. Zebrafish as a model for studying ovarian development: Recent advances from targeted gene knockout studies. Molecular and Cellular Endocrinology. 507, 1-19 (2020).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. Journal of Morphology. 218, 203-224 (1993).
- Matzuk, M. M., Burns, K. H., Viveiros, M. M., Eppig, J. J. Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation. Science. 296, 2178-2180 (2002).
- Liu, L., Ge, W. Growth differentiation factor 9 and its spatiotemporal expression and regulation in the zebrafish ovary. Biology of Reproduction. 76, 294-302 (2007).
- Zhou, R., Tsang, A. H., Lau, S. W., Ge, W. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the zebrafish ovary: evidence for potentially dual roles of PACAP in controlling final oocyte maturation. Biology of Reproduction. 85, 615-625 (2011).
- Li, J., Liu, Z., Wang, D., Cheng, C. H. K. Insulin-like growth factor 3 is involved in oocyte maturation in zebrafish. Biology of Reproduction. 84, 476-486 (2011).
- Pang, Y., Thomas, P. Role of G protein-coupled estrogen receptor 1, GPER, in inhibition of oocyte maturation by endogenous estrogens in zebrafish. Developmental Biology. 342, 194-206 (2010).
- Peyton, C., Thomas, P. Involvement of epidermal growth factor receptor signaling in estrogen inhibition of oocyte maturation mediated through the G protein-coupled estrogen receptor (Gper) in zebrafish (Danio rerio). Biology of Reproduction. 85, 42-50 (2011).
- Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., F, P. Functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (122), e55213 (2017).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics. 242, 44-52 (2013).
- Seki, S., et al. Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes. Reproduction. 135, 285-292 (2008).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments. , e54492 (2016).
- Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Scientific Reports. 6, 34555 (2016).
- Li, J., Bai, L., Liu, Z., Wang, W. Dual roles of PDE9a in meiotic maturation of zebrafish oocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2020).
