Прямое перепрограммирование фибробластов человека в миобласты для исследования терапии нервно-мышечных расстройств

Клеточные модели, полученные непосредственно из тканей человека, полезны для моделирования многих генетических нарушений человека, с преимуществом наличия оригинального геномного контекста и, во многих случаях, воспроизведения тех же молекулярных и клеточных признаков, наблюдаемых у пациентов. В области нервно-мышечных расстройств, биопсия мышц были отличным источником миобластов человека и помогли в выяснении патологических механизмов. Кроме того, они являются важным инструментом для in vivo тестирования препаратов и генной терапии. С одной стороны, вывод миобластов из фрагментов мышц относительно прост. С другой стороны, культура и поддержание первичных миобластов являются сложными, из-за их ограниченной скорости распространения и репликации сенесценции в пробирке¹. Альтернативой этим ограничениям является увековечение миобластов с вставкой человеческой теломеразы(HTERT)и/или циклин-зависимой киназы 4 (CDK4)^{генов 2,3}, с сохранением скелетных мышечных особенностей^4. Тем не менее, убаюка первичных миобластов по-прежнему зависит от биопсии мышц, хирургической процедуры с недостатками для пациентов, которые, во многих случаях, имеют свои мышцы в продвинутой дегенерации. Таким образом, мышцы этих пациентов состоят из значительной доли фиброзной и/или жировой ткани и дают меньше мышечных клеток, требующих очищения клеток ранее к увековечению.

В отличие от биопсии мышц, биопсия кожи более доступна и менее вредна для пациентов. Первичные фибробласты могут быть получены из фрагментов кожи в пробирке. Хотя фибробласты в первую очередь не страдают от мутаций, вызывающих нервно-мышечные расстройства, они могут быть трансдифференцированы в миобласты. Это может быть достигнуто путем вставки гена Myod, миогенного регулятивного транскрипции фактора^5. В этой рукописи мы описываем протокол для получения трансдифференцированных миобластов, от создания фибробластов культур до одержимости дифференцированных миотрубов (репрезентативное резюме метода изображено на рисунке 1).

Доклиническое тестирование терапевтических стратегий зависит от клеточных и животных моделей, несущих мутации, аналогичные мутациям, обнаруженным у пациентов. Хотя разработка моделей животных стала более осуществимой с развитием технологий редактирования генов, таких как CRISPR/Cas9^6,она по-прежнему является сложной и дорогостоящей. Таким образом, клеточные линии, полученные пациентом, являются доступным вариантом для моделей, охватывающих большой спектр мутаций таких заболеваний, как мышечная дистрофия Дюшенна (DMD). Использование и создание клеточных моделей имеют решающее значение для разработки персонализированной терапии таких патологий.

Среди персонализированных методов лечения, которые были исследованы, exon пропуская стратегии является одним из перспективных для различных мышечных^{дистрофий 7,8}. Эта стратегия состоит из производства более короткого, но функционального белка. Это выполняется путем сокрытия определения exon к сплайсоме, поэтому исключает мутировавшего экзона из конечного посланника. Это очень перспективная технология, которая была одобрена FDA для DMD. Таким образом, мы также описываем в этом протоколе, методы трансфект миобластов с двумя различными эксон пропуска соответствующих технологий: антисенс олигонуклеотиды (AON) и U7snRNA-адено-ассоциированных вирусов (AAV). AON transfection является хорошим инструментом для первоначального скрининга нескольких последовательностей, предназначенных для содействия exon пропуск⁹. Тем не менее, деятельность AONs является преходящим. Чтобы получить устойчивое выражение антисенсных последовательностей, мы также исследовали небольшие ядерные РНК (snRNAs) в сочетании с AAV, что позволяет ядерной локализации и включения в сращивания^{машины 10}. U7 является snRNA, участвующих в обработке гистона мРНК, которые могут быть разработаны, чтобы связать белки, которые будут перенаправлять его в сплайсеосомы и доставить антисенс^{последовательности 11}. Использование модифицированных SNRNAs U7 в сочетании с векторами AAV преодолевает ограничения AONs в результате продолжающегося выражения AONs и лучшей трансдукции тканей, представляющих^{интерес 12}. Мы используем клетки, полученные от пациентов DMD для этого протокола, чтобы проиллюстрировать экзон-пропуск стратегии.