Directe herprogrammering van menselijke fibroblasten in myoblasten om therapieën voor neuromusculaire aandoeningen te onderzoeken

Cellulaire modellen die rechtstreeks uit menselijke weefsels worden verkregen, zijn nuttig om veel menselijke genetische aandoeningen te modelleren, met het voordeel dat ze de oorspronkelijke genomische context hebben en in veel gevallen dezelfde moleculaire en cellulaire kenmerken reproduceren die bij de patiënten worden waargenomen. Op het gebied van neuromusculaire aandoeningen zijn spierbiopten een grote bron van menselijke myoblasten geweest en hebben ze geholpen bij de opheldering van pathologische mechanismen. Bovendien zijn ze een belangrijk hulpmiddel voor in vivo testen van geneesmiddelen en gentherapieën. Aan de ene kant is de afleiding van myoblasten uit spierfragmenten relatief eenvoudig. Aan de andere kant zijn de cultuur en het onderhoud van primaire myoblasten uitdagend, vanwege hun beperkte proliferatiesnelheid en replicatieve senescentie in vitro¹. Een alternatief voor deze beperkingen is het vereeuwigen van myoblasten met het inbrengen van de menselijke telomerase (hTERT) en/of cycline-afhankelijke kinase 4 (CDK4) genen^2,3, met behoud van skeletspierkenmerken⁴. Niettemin is de obtentie van primaire myoblasten nog steeds afhankelijk van spierbiopsie, een chirurgische procedure met nadelen voor de patiënten, die in veel gevallen hun spieren in geavanceerde degeneratie hebben. De spier van deze patiënten bestaat dus uit een aanzienlijk deel van het fibrotische en/of vetweefsel en levert minder spiercellen op, waardoor de cellen eerder moeten worden gezuiverd tot de vereeuwiging.

In tegenstelling tot spierbiopten zijn huidbiopten toegankelijker en minder schadelijk voor patiënten. Primaire fibroblasten kunnen in vitroworden afgeleid uit huidfragmenten . Hoewel fibroblasten niet voornamelijk worden beïnvloed door mutaties die neuromusculaire aandoeningen veroorzaken, kunnen ze worden getransdifferentieerd in myoblasten. Dit kan worden bereikt door het inbrengen van het Myod-gen, een myogene transcriptiefactor⁵. In dit manuscript beschrijven we het protocol om getransdifferentieerde myoblasten te verkrijgen, van de oprichting van fibroblastenculturen tot de obtentie van gedifferentieerde myostubes (een representatieve samenvatting van de methode is afgebeeld in figuur 1).

Preklinisch testen van therapeutische strategieën is afhankelijk van cellulaire en dierlijke modellen met mutaties die vergelijkbaar zijn met de mutaties die bij menselijke patiënten worden gevonden. Hoewel de ontwikkeling van diermodellen haalbaarder is geworden met de opmars van genbewerkingstechnologieën zoals CRISPR/Cas9⁶, is het nog steeds uitdagend en kostbaar. Van patiënten afgeleide cellijnen zijn dus een toegankelijke optie om modellen te hebben, die het grote spectrum van mutaties van ziekten zoals Duchenne spierdystrofie (DMD) bestrijken. Obtention en creatie van celmodellen zijn cruciaal voor de ontwikkeling van gepersonaliseerde therapieën voor dergelijke pathologieën.

Onder gepersonaliseerde therapieën die zijn onderzocht, exon skipping strategieën is een van de veelbelovende voor verschillende spierdystrofieën^7,8. Deze strategie bestaat uit het produceren van een korter maar functioneel eiwit. Dit wordt uitgevoerd door de exon-definitie te verbergen voor het spliceosome, waardoor de gemuteerde exon wordt uitgesloten van de laatste boodschapper. Dit is een veelbelovende technologie die is goedgekeurd door de FDA voor DMD. Zo beschrijven we in dit protocol ook methoden om myoblasten te transfecteren met twee verschillende exon skipping gerelateerde technologieën: antisense oligonucleotiden (AON) en U7snRNA-adeno-geassocieerd virus (AAV). AON-transfectie is een goed hulpmiddel voor de eerste screening van verschillende sequenties die zijn ontworpen om exon skipping⁹te bevorderen. De activiteit van AON’s is echter van voorbijgaande aard. Om een aanhoudende expressie van antisense sequenties te verkrijgen, onderzochten we ook kleine nucleaire RNA’s (snRNA’s) in combinatie met AAV, waardoor nucleaire lokalisatie en opname in de splicingmachines mogelijk werd¹⁰. U7 is een snRNA dat betrokken is bij de verwerking van histon mRNA dat kan worden ontworpen om eiwitten te binden die het naar het spliceosome zullen leiden en antisense sequenties¹¹zullen leveren. Het gebruik van gewijzigde U7-snRNA ‘s in combinatie met AAV-vectoren overwint beperkingen van AION ‘s , wat resulteert in een voortdurende expressie van de AION ‘s en een betere transductie van aandachtsweefsels¹². We gebruiken cellen afgeleid van DMD-patiënten voor dit protocol om de exon-skippingstrategie te illustreren.