Reprogrammation directe des fibroblastes humains en myoblastes pour étudier les thérapies pour les troubles neuromusculaires

Les modèles cellulaires obtenus directement à partir de tissus humains sont utiles pour modéliser de nombreux troubles génétiques humains, avec l’avantage d’avoir le contexte génomique original et, dans de nombreux cas, de reproduire les mêmes caractéristiques moléculaires et cellulaires observées chez les patients. Dans le domaine des troubles neuromusculaires, les biopsies musculaires ont été une grande source de myoblastes humains et ont contribué à l’élucidation des mécanismes pathologiques. En outre, ils sont un outil important pour les tests in vivo des médicaments et des thérapies géniques. D’une part, la dérivation des myoblastes à partir de fragments musculaires est relativement facile. D’autre part, la culture et le maintien des myoblastes primaires sont difficiles, en raison de leur taux de prolifération limité et de leur sénescence réplicative in vitro¹. Une alternative pour ces limitations est d’immortaliser les myoblastes avec l’insertion de la télomérase humaine (hTERT) et / ou kinase dépendante de la cycline 4 (CDK4) gènes^2,3, avec la préservation des caractéristiques musculaires squelettiques⁴. Néanmoins, l’obtention des myoblastes primaires dépend toujours de la biopsie de muscle, une procédure chirurgicale avec des inconvénients aux patients, qui, dans beaucoup de cas, ont leurs muscles dans la dégénérescence avancée. Ainsi, le muscle de ces patients est composé d’une proportion significative de tissu fibrotique et/ou adipeux et donne moins de cellules musculaires, nécessitant la purification des cellules précédemment à l’immortalisation.

Contrairement aux biopsies musculaires, les biopsies cutanées sont plus accessibles et moins nocives pour les patients. Les fibroblastes primaires peuvent être dérivés de fragments de peau in vitro. Bien que les fibroblastes ne soient pas principalement affectés par des mutations causant des désordres neuromusculaires, ils peuvent être transdifferentiated dans les myoblastes. Ceci peut être réalisé par l’insertion du gène Myod, un facteur de transcription réglementaire myogénique^5. Dans ce manuscrit, nous décrivons le protocole d’obtention des myoblastes transdifferentiated, de l’établissement des cultures de fibroblastes à l’obtention des myotubes différenciés (un résumé représentatif de la méthode est représenté dans la figure 1).

L’essai préclinique des stratégies thérapeutiques dépend des modèles cellulaires et animaux portant des mutations semblables aux mutations trouvées dans les patients humains. Bien que le développement de modèles animaux soit devenu plus réalisable avec l’avancée des technologies d’édition génétique telles que CRISPR/Cas9^6,il reste difficile et coûteux. Ainsi, les lignées cellulaires dérivées du patient sont une option accessible pour avoir des modèles, couvrant le large spectre de mutations de maladies telles que la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). L’obtention et la création de modèles cellulaires sont cruciales pour le développement de thérapies personnalisées pour de telles pathologies.

Parmi les thérapies personnalisées qui ont été étudiées, les stratégies de saut d’exon sont l’une des prometteuses pour différentes dystrophies^{musculaires 7,8}. Cette stratégie consiste à produire une protéine plus courte mais fonctionnelle. Ceci est effectué en cachant la définition d’exon à l’épissage, excluant ainsi l’exon muté du messager final. Il s’agit d’une technologie très prometteuse qui a été approuvé par la FDA pour le DMD. Ainsi, nous décrivons également dans ce protocole, des méthodes pour transfecter des myoblastes avec deux technologies liées de saut d’exon différentes : oligonucleotides antisens (AON) et virus U7snRNA-adeno-associés (AAV). La transfection AON est un bon outil pour le criblage initial de plusieurs séquences conçues pour favoriser le saut d’exon⁹. Toutefois, l’activité des OPN est transitoire. Afin d’obtenir une expression soutenue des séquences antisens, nous avons également exploré de petits ARN nucléaires (ARNR) combinés à l’AAV, permettant la localisation et l’inclusion nucléaires dans les machines d’épissage¹⁰. U7 est un ARNR impliqué dans le traitement de l’ARNm histone qui peut être conçu pour lier les protéines qui vont le rediriger vers le spliceosome et livrer des séquences antisens¹¹. L’utilisation de snARN U7 modifiés en combinaison avec des vecteurs AAV surmonte les limites des ANO, ce qui entraîne une expression continue des ANO et une meilleure transduction des tissus d’intérêt¹². Nous utilisons des cellules dérivées de patients atteints de DMD pour ce protocole pour illustrer la stratégie d’exon-saut.