Reprogramação Direta de Fibroblastos Humanos em Myoblasts para investigar terapias para distúrbios neuromusculares

Modelos celulares obtidos diretamente dos tecidos humanos são úteis para modelar muitas doenças genéticas humanas, com a vantagem de ter o contexto genômico original e, em muitos casos, reproduzir as mesmas marcas moleculares e celulares observadas nos pacientes. No campo das doenças neuromusculares, as biópsias musculares têm sido uma grande fonte de míbios humanos e têm ajudado na elucidação de mecanismos patológicos. Além disso, são uma ferramenta importante para testes in vivo de drogas e terapias genéticas. Por um lado, a derivação de míobios de fragmentos musculares é relativamente fácil. Por outro lado, a cultura e a manutenção dos myoblasts primários são desafiadoras, devido à sua taxa limitada de proliferação e senescência replicativa in vitro¹. Uma alternativa para essas limitações é imortalizar mioblasts com a inserção da telomerase humana (hTERT) e/ou kinase dependente de cíclina 4(CDK4) genes^2,3, com preservação das características do músculo esquelético⁴. No entanto, a obtenção de míbios primários ainda depende da biópsia muscular, procedimento cirúrgico com desvantagens para os pacientes, que, em muitos casos, têm seus músculos em degeneração avançada. Assim, o músculo desses pacientes é composto por uma proporção significativa de tecido fibroso e/ou adiposo e produz menos células musculares, exigindo a purificação das células anteriormente à imortalização.

Em contraste com as biópsias musculares, as biópsias da pele são mais acessíveis e são menos prejudiciais aos pacientes. Os fibroblastos primários podem ser derivados de fragmentos de pele in vitro. Embora os fibroblastos não sejam afetados principalmente por mutações que causam distúrbios neuromusculares, eles podem ser transdiferenciados em míobios. Isso pode ser alcançado pela inserção do gene Myod, um fator de transcrição regulatória miogênica⁵. Neste manuscrito, descrevemos o protocolo para obter míbios transdiferenciados, desde o estabelecimento de culturas de fibroblastos até a obtenção de miótubos diferenciados (um resumo representativo do método é retratado na Figura 1).

O teste pré-clínico de estratégias terapêuticas depende de modelos celulares e animais portadores de mutações semelhantes às mutações encontradas em pacientes humanos. Embora o desenvolvimento de modelos animais tenha se tornado mais viável com o avanço de tecnologias de edição de genes como o CRISPR/Cas9^6,ainda é desafiador e caro. Assim, as linhas celulares derivadas do paciente são uma opção acessível para ter modelos, abrangendo o grande espectro de mutações de doenças como distrofia muscular de Duchenne (DMD). A obtenção e criação de modelos celulares são cruciais para o desenvolvimento de terapias personalizadas para tais patologias.

Entre as terapias personalizadas que têm sido investigadas, as estratégias de pular exon é uma das promissoras para diferentes distrofias musculares^7,8. Esta estratégia consiste em produzir uma proteína mais curta, mas funcional. Isso é feito escondendo a definição do exon para o emendamento, excluindo assim o exon mutado do mensageiro final. Esta é uma tecnologia muito promissora que foi aprovada pela FDA para DMD. Assim, também descrevemos neste protocolo, métodos para transfetar mioblasts com duas tecnologias diferentes de exon ignorando: oligonucleotídeos antissamerados (AON) e vírus associado ao U7snRNA-adeno(AAV). A transfecção AON é uma boa ferramenta para a triagem inicial de várias sequências projetadas para promover o exon skipping⁹. No entanto, a atividade das AONs é transitória. Para obter uma expressão sustentada de sequências antissamparadas, também exploramos pequenas RNAs nucleares (snRNAs) combinadas com AAV, permitindo a localização nuclear e a inclusão no maquinário^{de emendas 10}. U7 é um snRNA envolvido no processamento de mRNA de histona que pode ser projetado para ligar proteínas que irão redirecioná-lo para o emendatório e entregar sequências antissameradas¹¹. O uso de U7 snRNAs modificados em combinação com vetores AAV supera limitações de AONs resultando em uma expressão contínua das AONs e melhor transdução de tecidos de interesse¹². Usamos células derivadas de pacientes DMD para este protocolo para ilustrar a estratégia de exon-skipping.