Reprogramación directa de fibroblastos humanos en mioblastos para investigar terapias para trastornos neuromusculares

Los modelos celulares obtenidos directamente de los tejidos humanos son útiles para modelar muchos trastornos genéticos humanos, con la ventaja de tener el contexto genómico original y, en muchos casos, reproducir las mismas señas de identidad moleculares y celulares observadas en los pacientes. En el campo de los trastornos neuromusculares, biopsias musculares han sido una gran fuente de mioblastos humanos y han ayudado en la elucidación de mecanismos patológicos. Además, son una herramienta importante para las pruebas in vivo de fármacos y terapias génicas. Por un lado, la derivación de mioblastos de fragmentos musculares es relativamente fácil. Por otro lado, la cultura y el mantenimiento de los mioblastos primarios son difíciles, debido a su limitada tasa de proliferación y senescencia replicativa in vitro^1. Una alternativa para estas limitaciones es inmortalizar los mioblastos con la inserción de los genes telomerasa humana(hTERT)y/o quinasa 4(CDK4)dependientes de la ciclina^2,3,con preservación de las características musculares esqueléticas⁴. Sin embargo, la obtensión de los mioblastos primarios sigue dependiendo de la biopsia muscular, un procedimiento quirúrgico con desventajas para los pacientes, que, en muchos casos, tienen sus músculos en degeneración avanzada. Así, el músculo de estos pacientes se compone de una proporción significativa de tejido fibromático y/o adiposo y produce menos células musculares, requiriendo la purificación de las células previamente a la inmortalización.

A diferencia de las biopsias musculares, las biopsias de la piel son más accesibles y son menos dañinas para los pacientes. Los fibroblastos primarios se pueden derivar de fragmentos de piel in vitro. Aunque los fibroblastos no se ven afectados principalmente por mutaciones que causan trastornos neuromusculares, pueden ser transdiferenciados en mioblastos. Esto se puede lograr mediante la inserción del gen Myod, un factor de transcripción regulador miogénico^5. En este manuscrito, describimos el protocolo para obtener mioblastos transdiferenciados, desde el establecimiento de cultivos de fibroblastos hasta la obtensión de miotubes diferenciados (se representa un resumen representativo del método en la Figura 1).

Las pruebas preclínicos de estrategias terapéuticas dependen de modelos celulares y animales portadores de mutaciones similares a las mutaciones encontradas en pacientes humanos. Aunque el desarrollo de modelos animales se ha vuelto más factible con el avance de tecnologías de edición genética como CRISPR/Cas9^6,sigue siendo desafiante y costoso. Por lo tanto, las líneas celulares derivadas del paciente son una opción accesible para tener modelos, cubriendo el gran espectro de mutaciones de enfermedades como la distrofia muscular de Duchenne (DMD). La obtención y la creación de modelos celulares son cruciales para el desarrollo de terapias personalizadas para este tipo de patologías.

Entre las terapias personalizadas que se han investigado, las estrategias de salto exon es una de las prometedoras para diferentes distrofias musculares^7,8. Esta estrategia consiste en producir una proteína más corta pero funcional. Esto se realiza ocultando la definición exon al empalme, excluyendo así el exon mutado del mensajero final. Esta es una tecnología muy prometedora que ha sido aprobada por la FDA para dmd. Así, también describimos en este protocolo, métodos para transfectar mioblasts con dos exon diferentes saltando tecnologías relacionadas: oligonucleótidos antisense (AON) y virus asociados al U7snRNA-adeno (AAV). La transfección AON es una buena herramienta para la proyección inicial de varias secuencias diseñadas para promover el salto exon^9. Sin embargo, la actividad de los AON es transitoria. Para obtener una expresión sostenida de secuencias antisense, también exploramos pequeñas ANR nucleares (SNRNAs) combinadas con AAV, permitiendo la localización e inclusión nuclear en la maquinaria de empalme^10. U7 es un snRNA implicado en el procesamiento de ARNm de histona que se puede diseñar para unir proteínas que lo redirigirán al empalme y entregarán secuencias antisense^11. El uso de SNRNAs U7 modificados en combinación con vectores AAV supera las limitaciones de los AONs, lo que resulta en una expresión continua de los ANV y una mejor transducción de tejidos de interés^12. Utilizamos células derivadas de pacientes con DMD para este protocolo para ilustrar la estrategia de salto exon.