Nöromüsküler Bozukluklar için Tedavileri Araştırmak için İnsan Fibroblastlarının Myoblastlara Doğrudan Yeniden Programlanması
Summary
Bu protokol, cilt fibroblastlarının miyoblastlara dönüşümünü ve farklılaşmalarını miyotüplere açıklar. Hücre hatları nöromüsküler bozukluğu olan hastalardan türetilmiştir ve patolojik mekanizmaları araştırmak ve terapötik stratejileri test etmek için kullanılabilir.
Abstract
Kas distrofilerinde hem patofizyoloji hem de terapötik hedeflerle ilgili araştırmalar, insan miyoblastlarının sınırlı proliferatif kapasitesi ile engellenmiştir. Birkaç fare modeli oluşturulmuştur, ancak bunlar hastalığın insan fizyopatolojisini gerçekten temsil etmez veya insanlarda bulunan geniş mutasyon spektrumunu temsil etmez. İnsan birincil mioblastlarının ölümsüzleştirilmesi bu sınırlamaya bir alternatiftir; bununla birlikte, hala invaziv olan ve kolayca bulunmayan kas biyopsilerine bağlıdır. Buna karşılık, cilt biyopsilerinin elde etmesi daha kolaydır ve hastalara daha az invazivdir. Cilt biyopsilerinden elde edilen fibroblastlar ölümsüzleştirilebilir ve miyoblastlara dönüştürülerek mükemmel miyojenik potansiyele sahip bir hücre kaynağı sağlanabilir. Burada fibroblast’ın hızlı ve doğrudan yeniden programlanma yöntemini miyojenik bir soyun içine açıklıyoruz. Fibroblastlar iki lentivirüs ile transdüklenir: birincil kültürü ölümsüzleştirmek için hTERT ve doksiksin eklenmesi üzerine fibroblastların myoblastlara dönüştürülmesini ve daha sonra geç farklılaşma belirteçlerini ifade eden olgun myotube’ları indükleyen tet-indükleyici bir MYOD. Bu hızlı transdifferentiation protokolü patolojik mekanizmaları araştırmak ve nöromüsküler bozukluklar için yenilikçi gen bazlı veya farmakolojik biyoterapileri araştırmak için güçlü bir aracı temsil eder.
Introduction
Doğrudan insan dokularından elde edilen hücresel modeller, orijinal genomik bağlama sahip olmanın ve çoğu durumda hastalarda gözlenen aynı moleküler ve hücresel ayırt edici özelliklerin yeniden üretilmesinin avantajıyla birçok insan genetik bozukluğunu modellemek için yararlıdır. Nöromüsküler bozukluklar alanında, kas biyopsileri insan mioblastlarının büyük bir kaynağı olmuştur ve patolojik mekanizmaların aydınlatılmasında yardımcı olmuştur. Ek olarak, ilaçların ve gen tedavilerinin in vivo testi için önemli bir araçtır. Bir yandan, miyeoblastların kas parçalarından türetimi nispeten kolaydır. Öte yandan, birincil mioblastların kültürü ve bakımı, sınırlı çoğalma oranları ve replikatif senescence in vitro1nedeniyle zordur. Bu sınırlamalar için bir alternatif, myoblastları insan telomerinin (hTERT) ve / veya sikline bağımlı kinaz 4 (CDK4) genlerinin yerleştirilmesi ile ölümsüzleştirmektir2,3, iskelet kası özelliklerinin korunması ile4. Bununla birlikte, primer mioblastların obtensiyonu hala hastalara dezavantajları olan ve çoğu durumda kasları ileri dejenerasyonda olan cerrahi bir prosedür olan kas biyopsisine bağlıdır. Bu nedenle, bu hastaların kasları fibrotik ve/veya yağ dokusunun önemli bir kısmından oluşur ve daha az kas hücresi vererek hücrelerin daha önce ölümsüzleşmeye arındırılmasını gerektirir.
Kas biyopsilerinin aksine cilt biyopsileri daha erişilebilirdir ve hastalar için daha az zararlıdır. Primer fibroblastlar in vitrocilt parçalarından türetilebilir. Fibroblastlar öncelikle nöromüsküler bozukluklara neden olan mutasyonlardan etkilenmeseler de, miyoblastlara transdinafferentiated olabilirler. Bu, miyojenik düzenleyici transkripsiyon faktörü5olan Myod geninin yerleştirilmesiyle elde edilebilir. Bu yazıda, fibroblast kültürlerinin kurulmasından farklılaştırılmış miyotütlerin itaatine kadar transdiferansitasyonlu miyeoplastlar elde etme protokolünü açıklıyoruz (yöntemin temsili bir özeti Şekil 1’detasvir edildi).
Terapötik stratejilerin klinik öncesi testleri, insan hastalarda bulunan mutasyonlara benzer mutasyonlar taşıyan hücresel ve hayvan modellerine bağlıdır. Hayvan modellerinin geliştirilmesi CRISPR/Cas96gibi gen düzenleme teknolojilerinin ilerlemesiyle daha uygulanabilir hale gelmesine rağmen, hala zorlu ve maliyetlidir. Bu nedenle, hasta kaynaklı hücre hatları, Duchenne kas distrofisi (DMD) gibi hastalığın geniş mutasyon spektrumunu kapsayan modellere sahip olmak için erişilebilir bir seçenektir. Hücre modellerinin geliştirilmesi ve oluşturulması, bu tür patolojiler için kişiselleştirilmiş tedavilerin geliştirilmesi için çok önemlidir.
Araştırılan kişiselleştirilmiş tedaviler arasında, ekson atlama stratejileri farklı kas distrofileri için umut verici olanlardan biridir7,8. Bu strateji daha kısa ama fonksiyonel bir protein üretmekten oluşur. Bu, spliceosome’a ekson tanımı gizlenerek gerçekleştirilir, bu nedenle mutasyona uğramış ekson son haberciden hariç tutulur. Bu, DMD için FDA tarafından onaylanan çok umut verici bir teknolojidir. Bu nedenle, bu protokolde miyeoplastları iki farklı ekson atlama ile dönüştürme yöntemlerini de açıklıyoruz: antisense oligonükleotidler (AON) ve U7snRNA-adeno ilişkili virüs (AAV). AON transfection, ekson atlamayı teşvik etmek için tasarlanmış çeşitli dizilerin ilk gösterimi için iyi bir araçtır9. Ancak, AON’lerin etkinliği geçicidir. Antisense dizilerinin sürekli bir ifadesini elde etmek için, AAV ile birlikte küçük nükleer RNA’ları (snRNA’lar) araştırdık, nükleer lokalizasyona ve birleştirme makinelerine dahil edilmesine izin verdik10. U7, histone mRNA’nın işlenmesinde yer alan ve onu spliceosome’a yönlendirecek ve antisense dizileri sunacak proteinleri bağlamak için tasarlanmış birsnRNA’dır 11. Değiştirilmiş U7 snRNA’larının AAV vektörleri ile birlikte kullanılması, AON’lerin sürekli bir ifadesi ve ilgi çekici dokuların daha iyi transdüksiyonu ile sonuçlanan AON sınırlamalarının üstesinden gelir12. Ekson atlama stratejisini göstermek için bu protokol için DMD hastalarından elde edilen hücreleri kullanıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
FM hücre hatlarını kaliteli elde etmek için bazı adımlar kritik öneme sahiptir. Cilt biyopsisi ne kadar erken işlenirse, sağlıklı fibroblast elde etme şansı o kadar artar. Fibroblast kültürlerinin geçiş sayısı da önemlidir. Birincil hücreler sınırlı proliferatif kapasiteye sahiptir ve birçok geçitten sonra çoğaltıcı senescence girerler. Bu nedenle, düşük bir geçiş sayısında fibroblast stoğuna sahip olmak ve hücreleri mümkün olan en erken geçişte dönüştürmek daha iyidir.
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Vincent Mouly’ye modelle ilgili geçmişteki bilgilerini paylaştığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (R01 NS043264 (K.M.F., ve R.B.W.),ABD Ulusal Artrit ve Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N., ve N.W.). N.W., Ohio Eyalet Üniversitesi/Nationwide Çocuk Hastanesi Kas Grubu ve Philippe Vakfı’ndan burs desteği almıştır. Bu çalışma aynı zamanda iç ihtiyati fonlar tarafından da desteklenmiştir ve ekson 2 atlama çalışmasının bir kısmı CureDuchenne (K.M.F.) ve Association Francaise Contre Les Myopathies tarafından da desteklenmiştir. IRB numarası: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 ve IBCSC#: IBS00000123.
Materials
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA, phenol red | Thermo Fisher | 2500056 | |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 20X Transfer buffer | Thermo Fisher | NP00061 | |
| 20X Tris-acetate SDS running buffer | Thermo Fisher | LA0041 | |
| 3-8% Tris-Acetate gel | Thermo Fisher | EA0378BOX | |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Antibiotic-Antimicotic 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody | Developmental Studies Hybridome Bank | MF20 supernatant | Dilution 1:50 |
| Antioxidant | Thermo Fisher | NP0005 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher | 23227 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D3571 | Dilution 1:1000 |
| Digitonin | Millipore Sigma | 300410250MG | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate | Thermo Fisher | 10569044 | |
| DNAse I set (250U) | Zymo Research Corporation | E1010 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP2653-5 | |
| Dup2 human primers | Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3' |
Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3' |
|
| Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | Dilution 1:200 |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16000 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:1000 |
| Halt Protease inhibitor cocktail 100X | Thermo Fisher | 78430 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hygromycin B | Thermo Fisher | 10687010 | |
| IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Li-Cor | 926-68071 | Dilution 1:5000 |
| Lab-Tek II CC2 chamber slide system | Thermo Fisher | 15852 | |
| Laemmli | Bioworld | 105700201 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000008 | |
| Matrigel GFR membrane matrix | Corning | 354230 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412P-4 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher | 51000001 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | GE Healthcare Life Sciences | 10600002 | |
| Normal Goat serum control | Thermo Fisher | 10000C | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | Li-Cor | 927-40003 | Blocking buffer for Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PCR master mix | Thermo Fisher | K0172 | |
| Phosphatase inhibitor | Thermo Fisher | A32957 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio Rad | 1610374 | |
| Puromycin | Thermo Fisher | A1113803 | |
| Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization | Li-Cor | 926-11021 | |
| RevertAid kit | Thermo Fisher | K1691 | |
| RNA Clean & Concentrator-25 | Zymo Research Corporation | R1018 | |
| Scalpels | Aspen Surgical | 372611 | |
| Skeletal Muscle Cell Differentiation medium | Promocell | C23061 | |
| Skeletal Muscle Cell Growth medium | Promocell | C23060 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 215682500 | |
| TRIzol reagent | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | |
| Ultra low temperature freezer | Thermo Scientific | 7402 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Labs | H1000 |
References
- Bigot, A., et al. Replicative aging down-regulates the myogenic regulatory factors in human myoblasts. Biology of the Cell. 100 (3), 189-199 (2008).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (34), (2011).
- Pantic, B., et al. Reliable and versatile immortal muscle cell models from healthy and myotonic dystrophy type 1 primary human myoblasts. Experimental Cell Research. 342 (1), 39-51 (2016).
- Thorley, M., et al. Skeletal muscle characteristics are preserved in hTERT/cdk4 human myogenic cell lines. Skeletal Muscle. 6 (1), 43 (2016).
- Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: Validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in duchen. Human Gene Therapy. 20 (7), 784-790 (2009).
- Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082 (2019).
- Echevarría, L., Aupy, P., Goyenvalle, A. Exon-skipping advances for Duchenne muscular dystrophy. Human molecular genetics. 27 (2), 163-172 (2018).
- Hwang, J., Yokota, T. Recent advancements in exon-skipping therapies using antisense oligonucleotides and genome editing for the treatment of various muscular dystrophies. Expert reviews in molecular medicine. 21, 5 (2019).
- Wein, N., et al. Efficient Skipping of Single Exon Duplications in DMD Patient-Derived Cell Lines Using an Antisense Oligonucleotide Approach. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (3), 199-207 (2017).
- De Angelis, F. G., et al. Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Δ48-50 DMD cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (14), 9456-9461 (2002).
- Gorman, L., Suter, D., Emerick, V., Schümperli, D., Kole, R. Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 4929-4934 (1998).
- Wein, N., et al. Translation from a DMD exon 5 IRES results in a functional dystrophin isoform that attenuates dystrophinopathy in humans and mice. Nature Medicine. 20 (9), 992-1000 (2014).
- Auré, K., Mamchaoui, K., Frachon, P., Butler-Browne, G. S., Lombès, A., Mouly, V. Impact on oxidative phosphorylation of immortalization with the telomerase gene. Neuromuscular Disorders. 17 (5), 368-375 (2007).
- Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. Myogenic defects in myotonic dystrophy. Developmental Biology. 265 (2), 294-301 (2004).
