Riprogrammazione diretta dei fibroblasti umani in mioblasti per indagare le terapie per i disturbi neuromuscolari

I modelli cellulari ottenuti direttamente dai tessuti umani sono utili per modellare molti disturbi genetici umani, con il vantaggio di avere il contesto genomico originale e, in molti casi, riprodurre gli stessi tratti distintivi molecolari e cellulari osservati nei pazienti. Nel campo dei disturbi neuromuscolari, le biopsie muscolari sono state una grande fonte di mioblasti umani e hanno contribuito alla spiegazione dei meccanismi patologici. Inoltre, sono uno strumento importante per il test in vivo di farmaci e terapie geniche. Da un lato, la derivazione dei mioblasti dai frammenti muscolari è relativamente facile. D’altra parte, la coltura e il mantenimento dei mioblasti primari sono impegnativi, a causa del loro limitato tasso di proliferazione e della senescenza replicativa in vitro¹. Un’alternativa a queste limitazioni è immortalare i mioblasti con^{l’inserimento}della telomerasi umana (hTERT) e/o della chinasi ciclina-dipendente 4 (CDK4)^{geni 2,}3 , con conservazione delle caratteristiche muscolari scheletriche⁴. Tuttavia, l’obtenzione dei mioblasti primari dipende ancora dalla biopsia muscolare, una procedura chirurgica con svantaggi per i pazienti, che, in molti casi, hanno i loro muscoli nella degenerazione avanzata. Pertanto, il muscolo di questi pazienti è composto da una proporzione significativa di tessuto fibrotico e / o adiposo e produce meno cellule muscolari, richiedendo la purificazione delle cellule in precedenza per l’immortalizzazione.

A differenza delle biopsie muscolari, le biopsie cutanee sono più accessibili e sono meno dannose per i pazienti. I fibroblasti primari possono essere derivati da frammenti cutanei in vitro. Sebbene i fibroblasti non siano principalmente influenzati da mutazioni che causano disturbi neuromuscolari, possono essere trasifferenti in mioblasti. Questo può essere ottenuto con l’inserimento del gene Myod, un fattore di trascrizione regolatore miogenico⁵. In questo manoscritto descriviamo il protocollo per ottenere mioblasti transdifferenziati, dalla creazione di colture di fibroblasti all’obtenzione di miotubi differenziati (un riassunto rappresentativo del metodo è raffigurato nella figura 1).

Il test preclinale delle strategie terapeutiche dipende da modelli cellulari e animali che portano mutazioni simili alle mutazioni riscontrate nei pazienti umani. Sebbene lo sviluppo di modelli animali sia diventato più fattibile con il progresso di tecnologie di editing genico come CRISPR/Cas9⁶, è ancora impegnativo e costoso. Pertanto, le linee cellulari derivate dal paziente sono un’opzione accessibile per avere modelli, coprendo l’ampio spettro di mutazioni di malattie come la distrofia muscolare di Duchenne (DMD). L’obtenzione e la creazione di modelli cellulari sono cruciali per lo sviluppo di terapie personalizzate per tali patologie.

Tra le terapie personalizzate che sono state studiate, le strategie di salto dell’esone è una delle promettenti per diverse distrofie^{muscolari 7,8}. Questa strategia consiste nel produrre una proteina più corta ma funzionale. Questo viene eseguito nascondendo la definizione di esone allo spliceosoma, escludendo quindi l’esone mutato dal messaggero finale. Questa è una tecnologia molto promettente che è stata approvata dalla FDA per dmd. Pertanto, descriviamo anche in questo protocollo, metodi per trasfetto i mioblasti con due diverse tecnologie correlate che saltano l’esone: oligonucleotidi antisense (AON) e virus associato all’U7snRNA-adeno (AAV). La trasfezione AON è un buon strumento per lo screening iniziale di diverse sequenze progettate per promuovere l’esone^{saltando 9}. Tuttavia, l’attività degli AON è transitoria. Per ottenere un’espressione sostenuta delle sequenze di antisense, abbiamo anche esplorato piccoli RNA nucleari (snRNA) combinati con AAV, consentendo la localizzazione nucleare e l’inclusione nei macchinari di giunzione¹⁰. U7 è uno snRNA coinvolto nell’elaborazione dell’mRNA istono che può essere progettato per legare le proteine che lo reindirizzeranno allo spliceosoma e forniranno sequenze di antisense¹¹. L’uso di U7 snRNA modificati in combinazione con vettori AAV supera i limiti delle AON con conseguente continua espressione delle AON e migliore trasduzione dei tessuti di interesse¹². Usiamo cellule derivate da pazienti affetti da DMD per questo protocollo per illustrare la strategia di esone-salto.