ここでは、DNAプログラム付着を用いた単細胞分解能でマイクロパターン細胞に対するプロトコルを提示する。このプロトコルは、ベンチトップフォトリソグラフィプラットフォームを使用して、ガラススライド上にDNAオリゴヌクレオチドのパターンを作成し、市販の相補オリゴヌクレオチドを有する細胞膜にラベルを付けます。オリゴのハイブリダイゼーションは、プログラムされた細胞接着をもたらす。
細胞の相対的な位置付けは、細胞と細胞の相互作用を組織する微小環境の重要な特徴です。同じタイプまたは異なるタイプの細胞間の相互作用を研究するために、マイクロパターン化技術が有用であることが証明された。DNAプログラムによる細胞集合体(DPAC)は、DNAハイブリダイゼーションを用いて細胞の基質や他の細胞への接着を標的とするマイクロパターニング技術です。DPACの最も基本的な操作は、脂質修飾オリゴヌクレオチドで細胞膜を修飾し、相補的なDNA配列でパターン化された基質上でそれらを流すことから始まります。細胞は、相補的なDNA配列を見つける場合にのみ、基質に選択的に付着します。非接着細胞は洗い流され、接着細胞のパターンが明らかになります。追加の操作には、細胞基板または細胞-細胞接着のさらなるラウンド、ならびに長期培養のための埋め込みヒドロゲルにDPACによって形成されたパターンを移すが含まれる。以前は、表面上のオリゴヌクレオチドをパターン化し、DNA配列を持つ細胞を修飾する方法には、それぞれ特殊な機器とカスタムDNA合成が必要でした。我々は、モジュラー形式を使用して展開された安価なベンチトップフォトリソグラフィーセットアップおよび市販のコレステロール修飾オリゴヌクレオチド(CMO)を利用して、プロトコルの更新版を報告する。CMO標識細胞はDNAパターン化基質に対して高効率で接着する。このアプローチは、複数の細胞タイプを高精度に一度にパターン化し、細胞外マトリックス内に埋め込まれたマイクロ組織の配列を作成するために使用することができます。この方法の利点は、その高解像度、マイクロパターンを破壊することなく3次元微小環境に細胞を埋め込む能力、および任意の細胞タイプのパターン化における柔軟性を含む。
組織における細胞の位置合わせは、微小環境1、2、3、4の重要な特徴である。空間制御された配置に生細胞をパターン化するために使用される技術は、分化4、5、6、7、8、細胞運動性9、形態形成10、11、代謝13、および細胞細胞相互作用7、14を研究するための貴重な実験ツールである.細胞のパターニングにはさまざまな方法があり、それぞれに利点と欠点3、4があります。マイクロコンタクト印刷やレーザーカットステンシルなど、細胞外マトリックス(ECM)タンパク質の接着島を作る方法は、シンプルでスケーラブルです。しかし、異なるECM分子に対する異なる細胞型の接着特性が15、16、17に類似していることが多いため、一度に1つまたは2つ以上の細胞型をパターン化することは困難である。より複雑な微小パターンは、光誘導分子吸着(LIMAP)を用いて作成することができ、UV光を用いてPEG被覆領域をアブレーションし、その後のタンパク質吸着を可能にする技術である18、19。このプロセスを繰り返して、複数の細胞タイプの高解像度マイクロパターンを作成できます。しかし、異なるタンパク質パッチへの細胞のクロス結合が起こり得、パターン特異性19に劣るパターンを生じる。マイクロメカニカル再構成可能な培養装置に細胞を播種するなどの物理的方法は、動的制御を伴う構造化された共培養を作成することができるが、マイクロコンタクト印刷またはLIMAP14,8のパターン設計において柔軟性がない。他の技術とは異なり、バイオプリンティングはヒドロゲル20,21内の細胞の3次元配置を作成することができる。しかし、バイオプリント構造は、他のマイクロパターニング技術よりもはるかに低い解像度を有し、数百ミクロン22の平均特徴サイズを有する。理想的な細胞パターニング法は、高解像度、パターン複数の細胞タイプ、簡単にアクセスできる機器や試薬を使用し、3次元(3D)細胞培養のためのヒドロゲルに成功したパターンを埋め込む能力を有するであろう。本稿では、DNAハイブリダイゼーションの柔軟性と速度を利用して細胞接着をターゲットとする細胞マイクロパターニング技術であるCMO-DPACについて紹介します。この方法は、以前のプロトコル23、24から、より手頃な価格、モジュラー、アクセス可能にしました。現在のプロトコルを使用すると、あらゆるラボが、特殊な機器や専門知識を持たない完全に機能するシステムをセットアップできるはずです。
DNAプログラムによる細胞組立(DPAC)は、細胞間の間隔と組織形状を正確に制御して、単細胞解像度で細胞をパターン化する強力な組織工学技術です。DPACでは、細胞膜にハイブリダイズするように設計された2つの脂質修飾オリゴを使用して、細胞膜をDNAオリゴヌクレオチド(オリゴ)で修飾しています。オリゴは疎水性脂質に結合しているため、それらがハイブリダイズする細胞膜25に迅速に分け、非共有結合分子の純疎水性を増加させ、それによって細胞表面26での寿命を増強する。オリゴは、他の細胞またはDNA機能化ガラススライド上の相補オリゴとハイブリダイズして、所定の組成、細胞間間隔、および幾何学23、24を有する定義された2Dまたは3D細胞パターンを作成することができる方法で細胞表面に提示される。パターン化されたマイクロ組織は、表面から酵素的に切断され、長期間にわたる3D培養のためにヒドロゲルに埋め込むことができます。原発細胞または幹細胞と組み合わせて使用すると、細胞の結果として得られるコレクションは、形態形成を受け、オルガノイド23、27、28に形成することができる。DPACは、競合するシグナル6,29に応答して成人の神経幹細胞運命のダイナミクスを調べ、乳腺上皮細胞23,28の自己組織化を研究し、間葉縮合27を通じて「組織折り紙」を生成するために適用された。
DPACは、複数の細胞集団の正確な配置を可能にし、(ミクロンの順序で)22、23の押出ベースのバイオプリンターよりも実質的に優れた解像度を有する。また、マイクロコンタクト印刷などのECMベースのパターン化方法とは異なり、DPACは、ECM被覆面15,23に対して異なる細胞タイプの差動接着を必要としない。組織の組成がその挙動にどのような影響を与えるか、細胞が決定を下す際に複数の細胞と微小環境の手掛かりをどのように統合するか、および細胞のペアがどのように相互作用するかについての質問に答えるのに理想的です。他のマイクロパターン化法よりもこの方法の利点は、単一の画像化平面における3D細胞培養に使用できることであり、組織自己組織化およびオルガノイド形態形成23、27、30のタイムラプス研究を促進する。
これらの利点にもかかわらず、DPACの実装は、カスタムオリゴヌクレオチド試薬の合成とDNAパターニング23、24のための特殊な機器へのアクセスを必要とし、広範な採用を制限しています。例えば、元のプロトコルで使用される最適脂質修飾オリゴ(DMO)は、カスタム合成、リグノセリック酸またはパルミチン酸で修飾、精製26としなければならない。このプロセスでは、DNAシンセサイザーと高速液体クロマトグラフィー装置の使用、ならびに機関および連邦規制の対象となるメチルアミンなどの関連試薬の購入が必要です。代わりに、DMOを一括購入することもできますが、これにはこの技術に対する前もってかなりの投資が必要です。
これらの制限を克服するために、カスタム合成されたMMOの代わりに市販のコレステロール修飾オリゴ(CMO)を使用するDPACの改訂版を開発しました。さらにコストを削減し、プラットフォームの柔軟性を高めるために、モジュラー、3オリゴシステムに変更しました。このプロトコルのユーザーは、各々の細胞集団に対して新しいコレステロール修飾オリゴを注文する代わりに、すべての細胞集団に同じコレステロール修飾オリゴ(「ユニバーサルアンカー」と「ユニバーサル共同アンカー」)を使用し、ユニバーサルアンカーと別のタイプのアダプタストランドの両方でハイブリダイズする安価で変更されていないオリゴ(「アダプタストランド」)を採用することができます。
元のDPACプロトコルのもう一つの制限は、高解像度の液体プリンタ(例えば、ナノeナブラー、バイオフォースナノサイエンス)23、24を用いてDNAパターンスライドを作成することであった。この器械は異常な決断および低い試薬の要求を自慢するが、ほとんどの機関にとって利用できない、比較的低い印刷率(およそ1特徴は毎秒パターン化される)。近年、DNAの特徴を表面にパターン化する2つのフォトリソグラフィ法が開発されました。今回、Viiolaたちの研究グループは、UV光30への曝露時に一本鎖DNAオリゴを共有結合するポリアクリルアミドおよびベンゾフェノンコーティングを使用した。この方法を用いて、細胞の収縮性と自己組織化の結果として、大規模なプログラムされた形状変化を受けた組織足場を作成することができた。シャイデラーらは、陽性フォトレジストのUV曝露を用い、アミン修飾DNAオリゴをアルデヒド機能化スライド29に選択的に露出させる方法を開発した。焼成および還元的アミノ化の後、アミン修飾DNAは表面に共有結合される。この方法は、空間的に自己再生および分化の手掛かりを提示する成人神経幹細胞の応答を調べるのに用いた。この記事では、シャイデラーらのプロトコルを適応させ、CMO標識細胞を捕捉するDNAパターンを作成します。このフォトパターニングプロトコルは、クリーンルームを使用せずに実行できます。それは簡単にベンチトップやヒュームフードに展開されている安価で市販の機器を使用しています。安価なまたはDIY(日曜大工)フォトリソグラフィー装置を使用すると、クリーンルーム設備にアクセスすることなく研究者にアクセスでき、研究者は時間やリソース31,32の大きな投資なしに技術を試すことができます。しかし、クリーンルーム施設で一般的に見られる市販のスピンコーターとマスクアライナーを使用することで、より良い分解能と複数のDNA特徴のアライメントを達成することができます。
ここでは、DNAベースの接着を用いて単細胞分解能で細胞をパターン化する方法について述べる。まず、正のフォトレジストを用いたフォトパターニングを使用して、アルデヒド修飾ガラス基板上にアミン修飾DNAの高解像度パターンを作成します。次に、スライドは非特異的な細胞の結合を減らすために処理され、PDMSフローセルはパターン化された領域の上に細胞を閉じ込めるために作成される。次に、細胞はコレステロールで機能する短いDNAオリゴヌクレオチドで標識され、その結果、細胞膜に挿入されます。その後、細胞はDNAマイクロパターンの上に流されます。ガラス表面上の細胞表面DNAとDNAとのハイブリダイゼーションにより、DNAパターンに対する細胞の特異的接着が生じます。非接着細胞は洗い流され、接着細胞パターンが明らかになります。このプロセスを繰り返して、複数のセルタイプをパターン化したり、多層構造を作成したりできます。必要に応じて、3D細胞培養のために細胞をECMに完全に埋め込むことができます。
本稿では、インビトロ細胞培養実験用の2Dおよび3Dにおける細胞の高解像度パターン化のための詳細なプロトコルを紹介する。この方法の以前に公開されたバージョンとは異なり、ここで紹介するプロトコルは使いやすさを重視しています:それは高度に特殊な装置を必要とせず、すべての試薬は、カスタム合成を必要とするのではなく、ベンダーから購入することができます。他の細胞顕微鏡法とは異なり、この方法は、細胞型の迅速かつ無数である:細胞外マトリックスタンパク質15に特異的な接着を必要としない。CMO-DPACによってパターン化された細胞は、マトリゲルまたはコラーゲンのような細胞外マトリックス内に埋め込むことができるので、その結果、押出印刷ベースの方法22で現在可能であるよりもはるかに高い空間分解能を有する3D培養が得られる。CMO-DPAC を使用して、スライドごとに数百から数千の顕微鏡機能を作成できるため、同時に多数の複製を実行できます。
このプロトコルの成功における最も重要なパラメータの1つは、パターン化されたスライドの上のフローセルに追加される細胞の密度です。理想的には、密度は少なくとも2500万個の細胞/mLでなければなりません。フローセルにロードすると、この細胞密度は、パターンの上にほぼ密接に詰まった単層の細胞をもたらす(補足図2B)。これらの高い細胞密度は、細胞がDNAスポットの上に直接落ち着き、接着する確率を最大化します。細胞密度を下げると、全体的なパターニング効率が低下します。このプロトコルのもう一つの重要なステップは、CMO溶液を追加する前にPBSまたは無血清培地中の細胞を完全に再懸濁させることです。CMOは細胞膜に非常に急速に分割し、CMO溶液を細胞ペレットに直接加えることは細胞の異種標識をもたらす。CMO溶液を細胞懸濁液に添加した後、細胞がCMOで均一に標識されるようにピペッティングして十分に混合することが重要です。インキュベーション後、過剰なCMOを複数の遠心分離と洗浄工程で徹底的に洗い流す必要があります。細胞懸濁液中に存在する過剰な遊離CMOは、ガラススライド上のパターン化されたアミン修飾DNAに結合し、懸濁液中のCMO修飾細胞のハイブリダイゼーションおよび接着を遮断する。時間もこのプロトコルの重要な考慮事項です。CMOを使用する場合は、できるだけ迅速に作業し、CMOの内部化を最小限に抑え、細胞の生存率を最大化するために、細胞を氷上に保つことが重要です。フローサイトメトリー実験では、CMOはMMOのように細胞表面上に長く持続せず、氷上での2時間にわたるCMO複合体の25%の損失が示されている36。さらに、細胞の処理時間が長くなるにつれて細胞の生存率が低下する。生存率は、迅速に働き、細胞を氷上に保ち、氷冷試薬を使用し、無血清培地を使用して栄養素を提供することで最大化することができます。
CMO-DPACは、細胞を高精度にパターニングすることで細胞生物学を研究する強力な方法ですが、限界があります。CMO-DPAC 実験は、特に複数の細胞タイプ、層、または3D細胞培養(補足ファイル1)で実験の複雑さが加えられるため、困難な場合があります。このプロトコルを起動する際に、実験的な障害が一般的になる可能性があります(表 1に示すように)。そのため、品質管理チェック(スライドにDNAが存在することを確認し、細胞にDNAが十分に標識されていることを確認する(ステップ8)、余分な細胞が完全に洗い流されていることを確認する)ことをお勧めします。この原稿に記載されている情報とその補足ファイルが、必要なトラブルシューティングを容易にすることを期待しています。
コレステロールは、細胞代謝、遺伝子発現、膜流動性37,38に影響を及ぼす生理活性分子である。これまでの研究では、単一細胞RNAシーケンシングを用いてCMO標識細胞およびLMO標識細胞の遺伝子発現に及ぼす影響を比較した。CMO標識HEK細胞は、非標識およびLMO標識細胞36と比較して遺伝子発現を変化させた。CMOを有する標識細胞は、コレステロールおよびスフィンゴ脂質輸送(GeneCards)に関連したAP2B1およびMALAT1、コレステロール蓄積39を調節する長い非コードRNAを含む、標識されていないコントロールに対する8つの遺伝子の差動発現(>1.5倍)をもたらした。軽微ながら、問題の実験が細胞内の代謝、膜動態、または他のコレステロール関連経路を研究している場合、これらの転写応答はそれにもかかわらず懸念される可能性があります。
このプロトコルは柔軟性があり、各実験のニーズに合わせて調整することができます。CMOは、特定の受容体を使用する代わりに脂質膜に挿入するので、この方法は細胞型に依存しない(HUVEC、MCF10A、HEKs、およびMCKがここで実証されている)。コレステロールは以前に発表されたLmoとは異なる疎水性アンカーですが、これまでのところ、同様に振る舞うことがわかりました。したがって、CMOは、神経幹細胞、線維芽細胞、末梢血単核細胞、腫瘍細胞、原発性乳腺上皮細胞6、23、27、29、36を含むがこれらに限定されない、これまでMMOで発表した多種多様な細胞タイプと連携することを期待する。.CMO標識はTLR9を刺激せず、プロトコルが免疫細胞と互換性があることを示唆している。CMOの膜取り込みは、細胞グリコカリックス35における全細胞サイズと負電荷の程度の関数である。このように、迅速な最適化に適した膜の組み込みの程度をテストするためのプロトコル(ステップ8)を含んでいます。各細胞パターンの特徴は、実験計画によって必然的に異なります(詳細については、補足ファイル1を参照)。DNAのパターン化のために上記のフォトパターニングプロトコルが推奨されますが、高分解能の液滴プリンタの使用など、アミン-DNA溶液の液滴を空間的に閉じ込める方法は何でも機能するはずです。パターンの解像度と最小フィーチャ間隔は、使用する方法によって異なります。また、このプロトコルのDNAフォトパターニングセクションを、膜発現亜鉛指40にハイブリダイズしたDNA、NHS共役DNA41を用いたDNA、および細胞表面のアジドシアル酸残基をホスフィン結合DNA42と反応させるなど、DNAで細胞を標識するために使用された他の方法と組み合わせることも理論的には可能である。.CMO-DPACは、細胞のペア間の相互作用の研究、「送信側」細胞から「受信機」細胞へのシグナルの伝達を調べた共培養実験、幹細胞分化に対する近くの細胞外手がかりの影響の研究など、細胞間の相互作用を厳しく制御する必要がある様々な実験に適用できます。.この方法は、細胞の移動を3次元で研究するために使用できるマイクロ組織、組織23、27への細胞の自己組織化、および細胞とECM27との動的相互作用を作成するためにも使用することができる。このプロトコルが、研究者自身の研究室で高解像度DNAベースの細胞パターニングの新しいアプリケーションを探求するためのアクセス可能なプラットフォームを研究者に提供することを期待しています。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、このプロトコルをテストしたジェレミー・ガルシアと、UCSFバイオメディカルマイクロとナノテクノロジーコアで機器に関するトレーニングを提供してくれたブーシャン・ハルビカールに感謝したいと考えています。この研究は、国防総省乳がん研究プログラム(W81XWH-10-1-1023およびW81XWH-13-1-0221)、NIH(U01CA199315、乳癌研究プログラム)からの助成金によって部分的にサポートされました。 DP2 HD080351-01、1R01CA190843-01、1R21EB019181-01A、および1R21CA182375-01A1、NSF(MCB1330864)、およびUCSFセルラー構築センター(DBI-154829)、NSF技術センターO.J.Sは、NSF大学院研究フェローシップ、シーベル奨学金、P.E.O.奨学金によって資金提供されました。Z.J.GとA.R.A.はチャン・ザッカーバーグ・バイオハブの調査官です。
2-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | Thermo Fisher Scientific | 155379 | |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Adapter with External SM1 Threads and Internal SM3 Thread | ThorLabs | SM3A1 | |
Aldehyde Functionalized Slides | Schott | Nexterion Slide AL | Store under dry conditions after opening. |
All Plastic Syringes, 1 mL | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
Amine-Modified DNA Oligo | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
Aspheric Condenser Lens | ThorLabs | ACL7560 | |
Borosilicate Disc, 6in Diameter X 1/2in Thick | Chemglass | CG-1906-23 | |
Cell Culture Dishes 60×15 mm style | Corning | 353002 | |
Cholesterol-Modified Oligo | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
Diamond Scribe | Excelta | 475B | |
DNA Oligonucleotide | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | |
Isopropyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | |
Methylene Chloride (Stabilized/Certified ACS) | Fisher Scientific | D37-4 | |
MF-321 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | |
Microposit S1813 Positive Photoresist | Kayaku Advanced Materials | n/a | |
Ø3" Adjustable Lens Tube, 0.81" Travel | ThorLabs | SM3V10 | |
Oven | Thermo Scientific | 51-028-112H | |
PE-50 Compact Benchtop Plasma Cleaning System | Plasma Etch | PE-50 | |
Photomask (custom) | CAD/Art Services | n/a | Minimum feature size guaranteed by CAD/Art Services is 10 microns. |
Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
RCT Basic Hot Plate | IKA | 3810001 | |
Silicon Wafer (100 mm) | University Wafer | 590 | |
Sodium Borohydride, 98%, granules | Acros Organics | 419471000 | |
Spin Coater Kit | Instras | SCK-200 | This is a low cost option, but any spin coater that can maintain a speed of 3000 rpm will suffice. |
SU-8 2075 | Microchem | Y111074 0500L1GL | |
SU-8 Developer | Microchem | Y020100 4000L1PE | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 2646340 | |
Syringe Needles | Sigma-Aldrich | Z192341 | |
T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current | ThorLabs | LEDD1B | |
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl dimethylchlorosilane | Gelest | SIT8170.0 | |
Triethylamine | Sigma-Aldrich | 90335 | |
Turbo DNase | Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
Tweezers Style N7 | VWR | 100488-324 | The curved shape of these tweezers is essential for delicately picking up the PDMS flow cells containing patterned tissues. |
UV LED (365 nm, 190 mW (Min) Mounted LED, 700 mA) | ThorLabs | M365L2 | |
Wafer Tweezers | Agar Scientific | T5063 | |
WHEATON Dry-Seal vacuum desiccator | Millipore Sigma | W365885 |