هنا نقدم بروتوكولا لخلايا الخلايا الدقيقة بدقة خلية واحدة باستخدام التصاق مبرمجة الحمض النووي. يستخدم هذا البروتوكول منصة تصوير ضوئي على سطح المقعد لإنشاء أنماط أوليغونوكليوتيدات الحمض النووي على شريحة زجاجية ثم تسميات أغشية الخلايا مع أوليغونوكليوتيدات تكميلية متاحة تجاريا. التهجين من oligos النتائج في التصاق الخلايا المبرمجة.
تحديد المواقع النسبية للخلايا هو سمة رئيسية من سمات البيئة الدقيقة التي تنظم التفاعلات بين الخلية والخلية. لدراسة التفاعلات بين الخلايا من نفس النوع أو نوع مختلف، أثبتت تقنيات الترنيخ الدقيق فائدتها. الحمض النووي المبرمجة تجميع الخلايا (DPAC) هو تقنية micropatterning التي تستهدف التصاق الخلايا إلى ركيزة أو غيرها من الخلايا باستخدام التهجين الحمض النووي. تبدأ العمليات الأساسية في DPAC بتزيين أغشية الخلايا مع أوليغونوكليوتيدات معدلة بالدهون ، ثم تتدفق عليها فوق ركيزة تم نقشها بتسلسل الحمض النووي التكميلي. تلتزم الخلايا بشكل انتقائي بالركيزة فقط عندما تجد تسلسل الحمض النووي التكميلي. يتم غسل الخلايا غير الملتصقة ، مما يكشف عن نمط من الخلايا الملتصقة. وتشمل العمليات الإضافية جولات أخرى من الركيزة الخلوية أو التصاق خلايا الخلية، فضلا عن نقل الأنماط التي شكلتها DPAC إلى هيدروجيل مضمن للثقافة على المدى الطويل. في السابق، كانت طرق نقش أوليغونوكليوتيدات على الأسطح وتزيين الخلايا بتسلسلات الحمض النووي تتطلب معدات متخصصة وتوليف الحمض النووي المخصص، على التوالي. نحن تقرير نسخة محدثة من البروتوكول، وذلك باستخدام الإعداد الضوئي benchtop رخيصة والكوليسترول المتاحة تجاريا تعديل أوليغونوكليوتيدات (CMOs) نشرت باستخدام شكل وحدات. تلتزم الخلايا المسماة بالكائنات الحية المغلقة بكفاءة عالية بالركائز المنقوشة بالحمض النووي. يمكن استخدام هذا النهج لنمط أنواع خلايا متعددة في وقت واحد بدقة عالية وإنشاء صفائف من الخلايا المجهرية المضمنة في مصفوفة خارج الخلية. وتشمل مزايا هذه الطريقة دقتها العالية، وقدرتها على تضمين الخلايا في بيئة صغيرة ثلاثية الأبعاد دون تعطيل الميكروبيترن، والمرونة في نقش أي نوع من الخلايا.
تحديد مواقع الخلايا فيما يتعلق بعضها البعض في الأنسجة هو سمة هامة من سمات البيئة الدقيقة1،2،3،4. التقنيات المستخدمة لنمط الخلايا الحية في ترتيبات تسيطر عليها مكانيا هي أدوات تجريبية قيمة لدراسة التمايز4،5،6،7،8، حركية الخلية9، مورفوجينيسيس10،11،12، التمثيل الغذائي13، وتفاعلات الخلية الخلية7،14 . وهناك مجموعة متنوعة من الأساليب لخلايا النقش، ولكل منها مزاياها الخاصةوعيوبها 3،4. الطرق التي تخلق جزر لاصقة من البروتينات مصفوفة خارج الخلية (ECM) ، مثل الطباعة microcontact والاستنسل قطع الليزر ، هي بسيطة وقابلة للتطوير. ومع ذلك، فمن الصعب لنمط أكثر من واحد أو اثنين من أنواع الخلايا في وقت واحد لأن خصائص لاصقة من أنواع الخلايا المختلفة لجزيئات ECM مختلفة غالبا ما تكون مماثلة15،16،17. يمكن إنشاء أجهزة مجهرية أكثر تعقيدا مع الامتزاز الجزيئي الناجم عن الضوء (LIMAP) ، وهي تقنية تستخدم ضوء الأشعة فوق البنفسجية لتبخيض المناطق المغلفة PEG والسماح لامتزاز البروتين اللاحق18،19. يمكن تكرار هذه العملية لإنشاء أجهزة مجهرية عالية الدقة ذات أنواع خلايا متعددة. ومع ذلك ، يمكن أن يحدث ربط الخلايا عبر بقع البروتين المختلفة ، مما يؤدي إلى سوء خصوصية النمط19. يمكن للأساليب الفيزيائية مثل زرع الخلايا على أجهزة الثقافة القابلة لإعادة التشكيل الميكروميكاميكية إنشاء ثقافات مشتركة منظمة مع التحكم الديناميكي ، ولكن دون مرونة في تصميم نمط الطباعة microcontact أو LIMAP14،8. على عكس التقنيات الأخرى ، يمكن للطباعة الحيوية إنشاء ترتيبات ثلاثية الأبعاد للخلايا داخل الهيدروجيل20،21. ومع ذلك ، فإن البنى المطبوعة بيولوجيا لديها دقة أقل بكثير من تقنيات micropatterning الأخرى ، مع متوسط حجم الميزة على ترتيب مئات الميكرونات22. وهناك طريقة مثالية لأنماط الخلية لديها عالية الدقة، وأنماط أنواع الخلايا المتعددة، واستخدام المعدات والكواشف التي يمكن الوصول إليها بسهولة، ولها القدرة على تضمين أنماط ناجحة في هيدروجيل لثقافة الخلية ثلاثية الأبعاد (3D). في هذه المقالة، نقدم CMO-DPAC، تقنية التصغير الخلية التي تستخدم مرونة وسرعة تهجين الحمض النووي لاستهداف الالتصاق الخلية إلى الركيزة. وقد تم تكييف هذه الطريقة من بروتوكولاتنا السابقة23،24 لجعلها أكثر بأسعار معقولة ، وحدات ، ويمكن الوصول إليها. وباستخدام البروتوكول الحالي، ينبغي أن يكون أي مختبر قادرا على إنشاء نظام يعمل بكامل طاقته دون أي معدات أو خبرات متخصصة.
الحمض النووي المبرمجة تجميع الخلايا (DPAC) هو تقنية قوية هندسة الأنسجة التي أنماط الخلايا في قرار خلية واحدة مع السيطرة الدقيقة على تباعد الخلايا الخلية وهندسة الأنسجة. في DPAC ، زينت أغشية الخلايا مع أوليغونوكليوتيدات الحمض النووي (أوليغوس) باستخدام اثنين من أوليغو تعديل الدهون المصممة للتهجين على غشاء الخلية. لأن يتم اقتران أوليغو إلى الدهون الكارهة للماء، فإنها تقسيم بسرعة إلى غشاء الخلية25 حيث أنها تهجين، وزيادة صافي رهاب الماء من الجزيئات غير ملزمة بشكل متناقض، وبالتالي تعزيز حياتهم على سطح الخلية26. يتم تقديم oligos على سطح الخلية بطريقة حيث يمكنهم التهجين مع أوليغو تكميلية على خلايا أخرى أو شرائح زجاجية تعمل بالحمض النووي لإنشاء أنماط خلايا 2D أو 3D محددة مع التركيب الموصوف ، وتباعد خلايا الخلية ، والهندسة23،24. يمكن أن تكون مشقوق microtissues منقوشة الخروج من السطح انزيميا وجزءا لا يتجزأ من هيدروجيل للثقافة 3D لفترات طويلة. عند استخدامها في تركيبة مع الخلايا الأساسية أو الخلايا الجذعية ، يمكن أن تخضع المجموعات الناتجة من الخلايا لنشأة مورفوجينيسيس وتتشكل إلى أعضاءعضوية 23و27و28. وقد تم تطبيق DPAC للتحقيق في ديناميات مصير الخلايا الجذعية العصبية الكبار ردا على الإشارات المتنافسة6,29, لدراسة التنظيم الذاتي للخلايا الظهارية الثديية23,28, وتوليد “اوريغامي الأنسجة” من خلال التكثيف mesenchymal27.
DPAC يسمح لوضع دقيق من مجموعات خلايا متعددة ولها دقة أفضل بكثير من الطابعات الحيوية القائمة على البثق (على ترتيب ميكرون)22،23. بالإضافة إلى ذلك ، على عكس أساليب النقش المستندة إلى ECM مثل الطباعة الدقيقة ، لا تتطلب DPAC التصاقا تفاضلا لأنواع الخلايا المختلفة بسطح مغلف ب ECM15و23. وهو مثالي للإجابة على الأسئلة حول كيفية تأثير تكوين الأنسجة على سلوكه ، وكيف تدمج الخلايا إشارات خلوية وبيئة دقيقة متعددة عند اتخاذ القرارات6،29، وكيف تتفاعل أزواج الخلايا مع بعضها البعض. ميزة هذه الطريقة على غيرها من أساليب micropatterning هو أنه يمكن استخدامه لثقافة الخلايا 3D في طائرة تصوير واحدة، وتسهيل دراسات الفاصل الزمني للتنظيم الذاتي الأنسجة والمورفوجيني العضوي23،27،30.
على الرغم من هذه المزايا، يتطلب التنفيذ الناجح ل DPAC تركيب كواشف أوليغونوكليوتيد مخصصة والوصول إلى المعدات المتخصصة لأنماط الحمض النووي23،24، مما يحد من التبني على نطاق واسع. على سبيل المثال، يجب أن تكون القلة المعدلة الدهون الأمثل (LMOs) المستخدمة في البروتوكول الأصلي توليفها خصيصا، وتعديلها مع حمض الليغنوسيريك أو حمض البالمتيك، وتنقية26. وتتطلب هذه العملية استخدام مركب الحمض النووي وأداة كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء، فضلا عن شراء الكواشف المرتبطة بها مثل الميثيلامين، وهي مادة خاضعة للرقابة وتخضع للوائح المؤسسية والاتحادية على حد سواء. وكبديل عن ذلك، يمكن شراء الكائنات الحية المحورة بشكل مخصص بكميات كبيرة، ولكن هذا يتطلب استثمارا مقدما كبيرا في التكنولوجيا.
للتغلب على هذه القيود، قمنا بتطوير نسخة منقحة من DPAC التي تستخدم أوليغو المعدلة الكوليسترول المتاحة تجاريا (CMOs) بدلا من الكائنات الحية المحورة توليفها حسب الطلب. لزيادة خفض التكاليف وزيادة مرونة المنصة ، قمنا بتغيير نظام وحدات ، ثلاثة أوليغو. بدلا من طلب أوليغو جديد معدلة الكوليسترول لكل مجموعة خلايا فريدة من نوعها، يمكن للمستخدم من هذا البروتوكول بدلا من ذلك استخدام نفس أوليغوس المعدلة الكوليسترول (“مرساة العالمي” و “العالمي المشترك مرساة”) لكل مجموعة من الخلايا ومن ثم توظيف غير مكلفة، أوليغو غير معدلة (“محول ستراند”) أن تهجين مع كل من مرساة العالمي وإما الحمض النووي أمين وظيفية على السطح أو حبلا محول من نوع خلية أخرى.
وكان قيد آخر من بروتوكول DPAC الأصلي أنه خلق الشرائح منقوشة الحمض النووي باستخدام طابعة سائلة عالية الدقة (على سبيل المثال، نانو eNabler، BioForce علوم النانو)23،24. في حين أن هذا الصك يضم دقة استثنائية ومتطلبات كاشف منخفضة، فإنه غير متوفر لمعظم المؤسسات ولديه معدل طباعة منخفض نسبيا (حوالي 1 سمة منقوشة في الثانية). في الآونة الأخيرة، تم تطوير طريقتين فوتوليتوغرافية لنمط ملامح الحمض النووي على الأسطح. فيولا وزملاؤه استخدام طلاء البولي أكريلاميد والبنزوفينون التي تربط بشكل متناقض واحد تقطعت بهم السبل Oligos الحمض النووي عند التعرض للأشعة فوق البنفسجية الخفيفة30. وباستخدام هذه الطريقة، تمكنوا من إنشاء سقالات أنسجة خضعت لتغييرات واسعة النطاق مبرمجة في الشكل نتيجة انقباض الخلايا والتنظيم الذاتي. Scheideler وآخرون وضعت طريقة تستخدم التعرض للأشعة فوق البنفسجية من مضاد للضوء إيجابية لفضح انتقائي أمين تعديل الحمض النووي oligos إلى الشريحة aldehyde وظيفية29. بعد الخبز والاختزال، يرتبط الحمض النووي المعدل بالأمين بالسطح بشكل مشترك. وقد استخدمت هذه الطريقة للتحقيق في استجابة الخلايا الجذعية العصبية البالغة للتجديد الذاتي المقدم مكانيا وإشارات التمايز. هذه المقالة تتكيف مع بروتوكول Scheideler وآخرون لإنشاء أنماط الحمض النووي التي سوف التقاط الخلايا CMO المسمى. يمكن تنفيذ بروتوكول التصوير الضوئي هذا دون استخدام غرفة نظيفة. ويستخدم معدات غير مكلفة ومتاحة تجاريا التي يتم نشرها بسهولة على مقاعد البدلاء أو غطاء محرك السيارة الدخان. استخدام معدات التصوير الضوئي غير مكلفة أو DIY (افعل ذلك بنفسك) يزيد من إمكانية الوصول إلى الباحثين دون الوصول إلى مرافق الغرف النظيفة ويسمح للباحثين بتجربة هذه التقنية دون استثمار كبير في الوقت أو الموارد31،32. ومع ذلك، يمكن تحقيق دقة أفضل ومحاذاة ميزات الحمض النووي متعددة باستخدام المغلف تدور التجارية وقناع المحاذاة الموجودة عادة في مرافق غرفة نظيفة.
هنا، نقوم بوصف طريقة لأنماط الخلايا بدقة الخلية الواحدة باستخدام التصاق الحمض النووي. أولا، يتم استخدام التصوير الضوئي باستخدام جهاز مضاد ضوئي إيجابي لإنشاء أنماط عالية الدقة من الحمض النووي المعدل الأمين على ركيزة زجاجية معدلة من ألدهيد. بعد ذلك، يتم التعامل مع الشريحة لتقليل مرفق الخلية غير محددة ويتم إنشاء خلايا تدفق PDMS لحصر الخلايا عبر المناطق المنقوشة. ثم يتم تسمية الخلايا مع أوليغونوكليوتيدات الحمض النووي قصيرة التي تعمل مع الكوليسترول ونتيجة لذلك إدراج في غشاء الخلية. ثم تتدفق الخلايا فوق الخلايا الدقيقة للحمض النووي. يؤدي التهجين بين الحمض النووي سطح الخلية والحمض النووي على سطح الزجاج إلى التصاق محدد للخلايا بنمط الحمض النووي. يتم غسل الخلايا غير الملتصقة ، مما يكشف عن نمط الخلية الملتصقة. يمكن تكرار هذه العملية لأنماط أنواع خلايا متعددة أو لإنشاء بنيات متعددة الطبقات. إذا رغبت في ذلك، يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ من الخلايا بالكامل في ECM لثقافة الخلية 3D.
في هذه المقالة، نقدم بروتوكول مفصل لأنماط عالية الدقة من الخلايا في 2D و 3D لتجارب ثقافة الخلايا المختبرية. وخلافا للإصدارات المنشورة سابقا من هذه الطريقة، يركز البروتوكول المعروض هنا على قابلية الاستخدام: فهو لا يتطلب معدات عالية التخصص ويمكن شراء جميع الكواشف من البائعين بدلا من الحاجة إلى توليف مخصص. وخلافا لغيرها من أساليب micropatterning الخلية، وهذا الأسلوب هو اللاأدرية سريعة والخلية من نوع: أنها لا تتطلب التصاق محددة إلى البروتينات مصفوفة خارج الخلية15. يمكن تضمين الخلايا المنقوشة بواسطة CMO-DPAC داخل مصفوفة خارج الخلية مثل Matrigel أو Collagen ، مما يؤدي إلى ثقافات ثلاثية الأبعاد بدقة مكانية أعلى بكثير مما هو ممكن حاليا مع الطرق القائمة على الطباعةالبثق 22. يمكن استخدام CMO-DPAC لإنشاء مئات إلى آلاف الميزات المجهرية لكل شريحة ، مما يسمح بإجراء العديد من النسخ المتماثلة في نفس الوقت.
واحدة من أهم المعلمات في نجاح هذا البروتوكول هو كثافة الخلايا المضافة إلى خلايا التدفق على رأس الشريحة المنقوشة. من الناحية المثالية ، يجب أن تكون الكثافة على الأقل 25 مليون خلية / مل. عند تحميلها في خلايا التدفق، تؤدي هذه الكثافة من الخلايا إلى طبقة أحادية معبأة تقريبا من الخلايا فوق النمط(الشكل التكميلي 2B). هذه الكثافات الخلية العالية تعظيم احتمال أن الخلية سوف يستقر مباشرة على رأس بقعة الحمض النووي والالتزام. تقليل كثافة الخلية سوف يقلل من كفاءة النقش الكلي. خطوة حاسمة أخرى في هذا البروتوكول هو تماما إعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني أو وسائل الإعلام الخالية من المصل قبل إضافة حل CMO. تقسيم CMOs بسرعة كبيرة في أغشية الخلايا وإضافة محلول CMO مباشرة إلى بيليه الخلية سيؤدي إلى وضع علامات غير متجانسة للخلايا. بعد إضافة حل CMO إلى تعليق الخلية ، من المهم خلط جيدا عن طريق الأنابيب بحيث يتم تسمية الخلايا بشكل موحد مع منظمات الإدارة الجماعية. بعد الحضانات ، من الضروري غسل منظمات الإدارة الجماعية الزائدة جيدا من خلال أجهزة الطرد المركزي المتعددة وخطوات الغسيل. سوف يرتبط CMO الحرة الزائدة الموجودة في تعليق الخلية إلى الحمض النووي المعدلة الأمين منقوشة على الشريحة الزجاجية، ومنع التهجين والالتصاق من الخلايا المعدلة CMO في التعليق. الوقت هو أيضا الاعتبار الرئيسي لهذا البروتوكول. من المهم العمل بأسرع وقت ممكن عند استخدام منظمات الإدارة الجماعية والحفاظ على الخلايا على الجليد من أجل تقليل استيعاب منظمات الإدارة الجماعية وتحقيق أقصى قدر من صلاحية الخلية. وقد أظهرت تجارب قياس التدفق الخلوي أن منظمات الإدارة الجماعية لا تستمر طالما على سطح الخلية مثل الكائنات الحية المحورة ، مع فقدان 25٪ من مجمعات CMO على مدى ساعتين من الحضانة على الجليد36. وعلاوة على ذلك، فإن صلاحية الخلايا تنخفض مع زيادة وقت التعامل مع الخلية. يمكن تعظيم الجدوى من خلال العمل بسرعة، والحفاظ على الخلايا على الجليد، واستخدام الكواشف الباردة الجليد، واستخدام وسائل الإعلام الخالية من المصل لتوفير بعض المواد الغذائية.
على الرغم من أن CMO-DPAC يمكن أن يكون وسيلة قوية لدراسة بيولوجيا الخلايا عن طريق نقش الخلايا بدقة عالية ، إلا أن لها حدودها. يمكن أن تكون تجارب CMO-DPAC صعبة ، خاصة مع إضافة التعقيد التجريبي مع أنواع خلايا متعددة أو طبقات أو ثقافة خلايا ثلاثية الأبعاد(ملف تكميلي 1). يمكن أن تكون الإخفاقات التجريبية شائعة عند بدء تشغيل هذا البروتوكول، كما هو موضح في الجدول 1. لذلك، نوصي المستخدمين بإجراء فحوصات لمراقبة الجودة (التأكد من وجود الحمض النووي على الشريحة، مما يؤكد أن الخلايا تحمل علامة كافية بالحمض النووي (الخطوة 8)، مما يؤكد أن الخلايا الزائدة قد جرفت تماما، وما إلى ذلك) للتأكد من نجاح التجربة وتحديد الخطوات التي قد تتطلب المزيد من التحسين. نأمل أن تساعد المعلومات الواردة في هذه المخطوطة وملفاتها التكميلية في تسهيل أي استكشاف مطلوب لأعطال وإصلاحها.
الكوليسترول هو جزيء النشطة بيولوجيا التي قد تؤثر على استيعاب التمثيل الغذائي للخلايا, التعبير الجيني, وسيولة الغشاء37,38. قارنت دراسة سابقة الآثار على التعبير الجيني للخلايا المسماة CMO و LMO باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. وقد غيرت خلايا HEK المسماة CMO التعبير الجيني مقارنة بالخلايا غير المسماة والخلايا التي تحمل علامة LMO36. أدى وضع العلامات على الخلايا ذات الخلايا ذات العلامات CMOs إلى التعبير التفاضلي (> 1.5 أضعاف) لثماني جينات نسبة إلى الضوابط غير المسماة ، بما في ذلك AP2B1 ، والتي تم ربطها بالكولسترول والنقل sphingolipid (GeneCards) ، وMALT1 ، وهو حمض نووي طويل غير ترميز ينظم تراكم الكوليسترول39. في حين طفيفة، قد تكون هذه الاستجابات النسخية مع ذلك مصدر قلق إذا كانت التجربة المعنية تدرس التمثيل الغذائي، ديناميات الأغشية، أو غيرها من المسارات المرتبطة بالكوليسترول في الخلايا.
هذا البروتوكول مرن ويمكن تعديله لتلبية احتياجات كل تجربة. لأن CMO يدخل نفسه في غشاء الدهون بدلا من استخدام أي مستقبلات محددة، والأسلوب هو نوع الخلية الملحد (HUVECs، MCF10As، HEKs، و MDCKs وقد ثبت هنا). على الرغم من أن الكوليسترول هو مرساة مسعورة مختلفة عن الكائنات الحية المحورة المنشورة سابقا ، فقد وجدناها حتى الآن تتصرف بالمثل. وهكذا، فإننا نتوقع من منظمات الإدارة الجماعية للعمل مع أي من مجموعة واسعة من أنواع الخلايا التي نشرناها سابقا مع الكائنات الحية المحورة، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر الخلايا الجذعية العصبية، والخلايا الليفية، والخلايا أحادية النووية في الدم المحيطي، والخلايا السرطانية، والخلايا الظهارية الثديية الأولية6،23،27،29،36 . لا يحفز وضع العلامات على CMO TLR9 ، مما يشير إلى أن البروتوكول متوافق مع الخلايا المناعية. دمج الغشاء من CMO هو وظيفة من إجمالي حجم الخلية ودرجة الشحن السلبي في الخلية الجليكوكاليx35. وهكذا، قمنا بتضمين بروتوكول (الخطوة 8) لاختبار مدى دمج الأغشية التي يمكن أن تكون قابلة للتحسين السريع. الميزات المحددة لكل نمط الخلية سوف تختلف حتما على أساس التصميم التجريبي (انظر الملف التكميلي 1 لمزيد من التوجيه). على الرغم من أن بروتوكول التصوير الضوئي الموصوف أعلاه لتكتكز الحمض النووي يوصى به ، إلا أن أي طريقة لحصر قطرات محلول الأمين الحمض النووي مكانيا يجب أن تعمل ، مثل استخدام طابعات قطرات عالية الدقة. تختلف دقة النقش والحد الأدنى لتباعد المعالم استنادا إلى الطريقة المستخدمة. ومن الممكن نظريا أيضا الجمع بين أقسام الحمض النووي photopatterning من هذا البروتوكول مع الأساليب الأخرى التي تم استخدامها لتسمية الخلايا مع الحمض النووي، مثل مع الحمض النووي المهجن إلى أصابع الزنك المعبر عنها غشاء40،وذلك باستخدام الحمض النووي41NHS-المقترنة، والتفاعل مع بقايا حمض الرياليك azido على سطح الخلية مع الحمض النووي الفوسفينالمقترنة 42 . يمكن تطبيق CMO-DPAC على مجموعة متنوعة من التجارب التي تتطلب رقابة مشددة على تباعد خلايا الخلية ، بما في ذلك دراسات التفاعلات بين أزواج الخلايا ، وتجارب الثقافة المشتركة التي تبحث في نقل الإشارات من خلايا “المرسل” إلى خلايا “المتلقي” ، والتحقيقات في تأثير الإشارات خارج الخلية القريبة علىتمايزالخلايا الجذعية 6،29 . ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لإنشاء microtissues التي يمكن استخدامها لدراسة هجرة الخلايا في ثلاثة أبعاد، والتنظيم الذاتي للخلايا في الأنسجة23،27، والتفاعل الديناميكي بين الخلايا وECM27. نأمل أن يوفر هذا البروتوكول للباحثين منصة يمكن الوصول إليها لاستكشاف تطبيقات جديدة لأنماط الخلايا عالية الدقة القائمة على الحمض النووي في مختبراتهم الخاصة.
The authors have nothing to disclose.
ويود المؤلفان أن يشكرا جيريمي غارسيا على اختبار هذا البروتوكول وبوشان خاربيكار على توفير التدريب على المعدات في جامعة كاليفورنيا في سان جرما مايكرو الطبية الحيوية وتكنولوجيا النانو الأساسية. تم دعم هذا البحث جزئيا من خلال منح من وزارة الدفاع برنامج أبحاث سرطان الثدي (W81XWH-10-1-1023 وW81XWH-13-1-0221)، المعاهد القومية للصحة (U01CA199315، DP2 HD080351-01، 1R01CA190843-01، 1R21EB019181-01A، و1R21CA182375-01A1)، وNSF (MCB1330864)، ومركز UCSF للبناء الخلوي (DBI-1548297)، وهو مركز العلوم والتكنولوجيا NSF. تم تمويل O.J.S من قبل زمالة أبحاث الدراسات العليا NSF ، ومنحة سيبل ، ومنحة P.E.O. (زي جي جي) و(آر آر أي) محققان من (تشان زوكربيرج بيو هوب)
2-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | Thermo Fisher Scientific | 155379 | |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Adapter with External SM1 Threads and Internal SM3 Thread | ThorLabs | SM3A1 | |
Aldehyde Functionalized Slides | Schott | Nexterion Slide AL | Store under dry conditions after opening. |
All Plastic Syringes, 1 mL | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
Amine-Modified DNA Oligo | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
Aspheric Condenser Lens | ThorLabs | ACL7560 | |
Borosilicate Disc, 6in Diameter X 1/2in Thick | Chemglass | CG-1906-23 | |
Cell Culture Dishes 60×15 mm style | Corning | 353002 | |
Cholesterol-Modified Oligo | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
Diamond Scribe | Excelta | 475B | |
DNA Oligonucleotide | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | |
Isopropyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | |
Methylene Chloride (Stabilized/Certified ACS) | Fisher Scientific | D37-4 | |
MF-321 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | |
Microposit S1813 Positive Photoresist | Kayaku Advanced Materials | n/a | |
Ø3" Adjustable Lens Tube, 0.81" Travel | ThorLabs | SM3V10 | |
Oven | Thermo Scientific | 51-028-112H | |
PE-50 Compact Benchtop Plasma Cleaning System | Plasma Etch | PE-50 | |
Photomask (custom) | CAD/Art Services | n/a | Minimum feature size guaranteed by CAD/Art Services is 10 microns. |
Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
RCT Basic Hot Plate | IKA | 3810001 | |
Silicon Wafer (100 mm) | University Wafer | 590 | |
Sodium Borohydride, 98%, granules | Acros Organics | 419471000 | |
Spin Coater Kit | Instras | SCK-200 | This is a low cost option, but any spin coater that can maintain a speed of 3000 rpm will suffice. |
SU-8 2075 | Microchem | Y111074 0500L1GL | |
SU-8 Developer | Microchem | Y020100 4000L1PE | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 2646340 | |
Syringe Needles | Sigma-Aldrich | Z192341 | |
T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current | ThorLabs | LEDD1B | |
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl dimethylchlorosilane | Gelest | SIT8170.0 | |
Triethylamine | Sigma-Aldrich | 90335 | |
Turbo DNase | Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
Tweezers Style N7 | VWR | 100488-324 | The curved shape of these tweezers is essential for delicately picking up the PDMS flow cells containing patterned tissues. |
UV LED (365 nm, 190 mW (Min) Mounted LED, 700 mA) | ThorLabs | M365L2 | |
Wafer Tweezers | Agar Scientific | T5063 | |
WHEATON Dry-Seal vacuum desiccator | Millipore Sigma | W365885 |