Hier stellen wir ein Protokoll für Mikrostrukturzellen mit Einzelzellauflösung unter Verwendung von DNA-programmierter Adhäsion vor. Dieses Protokoll verwendet eine Benchtop-Photolithographie-Plattform, um Muster von DNA-Oligonukleotiden auf einem Glasobjektträger zu erzeugen und dann Zellmembranen mit kommerziell erhältlichen komplementären Oligonukleotiden zu markieren. Die Hybridisierung der Oligos führt zu einer programmierten Zelladhäsion.
Die relative Positionierung von Zellen ist ein Schlüsselmerkmal der Mikroumgebung, die Zell-Zell-Interaktionen organisiert. Um die Wechselwirkungen zwischen Zellen des gleichen oder eines anderen Typs zu untersuchen, haben sich Mikrostrukturierungstechniken als nützlich erwiesen. DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) ist eine Mikrostrukturierungstechnik, die auf die Adhäsion von Zellen an einem Substrat oder anderen Zellen mittels DNA-Hybridisierung abzielt. Die grundlegendsten Operationen in DPAC beginnen mit der Dekoration von Zellmembranen mit lipidmodifizierten Oligonukleotiden und fließen sie dann über ein Substrat, das mit komplementären DNA-Sequenzen strukturiert wurde. Zellen haften nur dort selektiv am Substrat, wo sie eine komplementäre DNA-Sequenz finden. Nicht adhärente Zellen werden weggewaschen, wodurch ein Muster von adhärenten Zellen aufgedeckt wird. Weitere Operationen umfassen weitere Runden der Zellsubstrat- oder Zell-Zell-Adhäsion sowie die Übertragung der von DPAC gebildeten Muster in ein Einbettungshydrogel für die Langzeitkultur. Bisher erforderten Methoden zur Strukturierung von Oligonukleotiden auf Oberflächen und zur Dekoration von Zellen mit DNA-Sequenzen spezielle Geräte bzw. eine benutzerdefinierte DNA-Synthese. Wir berichten über eine aktualisierte Version des Protokolls, die ein kostengünstiges Tisch-Photolithographie-Setup und kommerziell erhältliche cholesterinmodifizierte Oligonukleotide (CMOs) verwendet, die in einem modularen Format eingesetzt werden. CMO-markierte Zellen haften mit hoher Effizienz an DNA-gemusterten Substraten. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um mehrere Zelltypen gleichzeitig mit hoher Präzision zu strukturieren und Arrays von Mikrogeweben zu erzeugen, die in eine extrazelluläre Matrix eingebettet sind. Zu den Vorteilen dieser Methode gehören ihre hohe Auflösung, die Fähigkeit, Zellen in eine dreidimensionale Mikroumgebung einzubetten, ohne das Mikromuster zu stören, und die Flexibilität bei der Strukturierung jedes Zelltyps.
Die Positionierung von Zellen zueinander in einem Gewebe ist ein wichtiges Merkmal der Mikroumgebung1,2,3,4. Techniken, die verwendet werden, um lebende Zellen in räumlich kontrollierte Anordnungen zustrukturieren,sind wertvolle experimentelle Werkzeuge zur Untersuchung der Differenzierung4,5,6,7,8, Zellmotilität9, Morphogenese10,11,12, Metabolismus13und Zell-Zell-Interaktionen7,14 . Es gibt eine Vielzahl von Methoden zur Strukturierung von Zellen, jede mit ihren eigenen Vor- und Nachteilen3,4. Methoden, die Klebstoffinseln aus extrazellulären Matrixproteinen (ECM) erzeugen, wie Mikrokontaktdruck und lasergeschnittene Schablonen, sind einfach und skalierbar. Es ist jedoch schwierig, mehr als einen oder zwei Zelltypen gleichzeitig zu strukturieren, da die Adhäsionseigenschaften verschiedener Zelltypen zu verschiedenen ECM-Molekülen oft ähnlich sind15,16,17. Komplexere Mikromuster können mit lichtinduzierter molekularer Adsorption (LIMAP) erzeugt werden, einer Technik, die UV-Licht verwendet, um PEG-beschichtete Regionen abzutragen und eine nachfolgende Proteinadsorption zu ermöglichen18,19. Dieser Vorgang kann wiederholt werden, um hochauflösende Mikromuster mit mehreren Zelltypen zu erstellen. Es kann jedoch zu einer Kreuzbindung von Zellen an die verschiedenen Proteinpflaster kommen, was zu einer schlechten Musterspezifität führt19. Physikalische Methoden wie das Seeding von Zellen auf mikromechanische rekonfigurierbare Kulturgeräte können strukturierte Co-Kulturen mit dynamischer Kontrolle erzeugen, jedoch ohne die Flexibilität im Musterdesign von Mikrokontaktdruck oder LIMAP14,8. Im Gegensatz zu den anderen Techniken kann bioprinting dreidimensionale Anordnungen von Zellen innerhalb der Hydrogele20,21 erzeugen. Biogedruckte Konstrukte haben jedoch eine viel geringere Auflösung als andere Mikrostrukturierungstechniken, mit einer durchschnittlichen Merkmalsgröße in der Größenordnung von Hunderten von Mikrometern22. Eine ideale Zellmusterungsmethode hätte eine hohe Auflösung, mustert mehrere Zelltypen, verwendet Geräte und Reagenzien, die leicht zugänglich sind, und hätte die Fähigkeit, erfolgreiche Muster in ein Hydrogel für die dreidimensionale (3D) Zellkultur einzubetten. In diesem Artikel stellen wir CMO-DPAC vor, eine Zellmikrostrukturierungstechnik, die die Flexibilität und Geschwindigkeit der DNA-Hybridisierung nutzt, um die Zelladhäsion an einem Substrat zu erreichen. Diese Methode wurde von unseren vorherigen Protokollen23,24 angepasst, um sie erschwinglicher, modularer und zugänglicher zu machen. Mit dem aktuellen Protokoll sollte jedes Labor in der Lage sein, ein voll funktionsfähiges System ohne spezielle Ausrüstung oder Fachwissen einzurichten.
DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) ist eine leistungsstarke Tissue-Engineering-Technik, die Zellen mit Einzelzellauflösung mit präziser Kontrolle über den Zellabstand und die Gewebegeometrie mustert. In DPAC werden Zellmembranen mit DNA-Oligonukleotiden (Oligos) dekoriert, wobei zwei lipidmodifizierte Oligos verwendet werden, die auf der Zellmembran hybridisiert werden sollen. Da die Oligos an hydrophobe Lipide konjugiert sind, teilen sie sich schnell in die Zellmembran25 auf, wo sie hybridisieren, wodurch die Nettohydrophobie der nicht kovalent gebundenen Moleküle erhöht und dadurch ihre Lebensdauer an der Zelloberflächeverlängert wird 26. Die Oligos werden auf der Zelloberfläche so dargestellt, dass sie mit komplementären Oligos auf anderen Zellen oder DNA-funktionalisierten Objektträgern hybridisieren können, um definierte 2D- oder 3D-Zellmuster mit vorgeschriebener Zusammensetzung, Zell-Zell-Abstand und Geometrie zu erzeugen23,24. Die gemusterten Mikrogewebe können enzymatisch von der Oberfläche abgespalten und für eine längere 3D-Kultur in ein Hydrogel eingebettet werden. In Kombination mit Primärzellen oder Stammzellen können die resultierenden Zellansammlungen einer Morphogenese unterzogen werden und sich zu organoiden23,27,28 bilden. DPAC wurde angewendet, um die Dynamik des Schicksals adulter neuraler Stammzellen als Reaktion auf konkurrierende Signale zu untersuchen6,29, um die Selbstorganisation von Brustepithelzellen23,28zu untersuchen und “Gewebeorigami” durch mesenchymale Kondensation27zu erzeugen.
DPAC ermöglicht die präzise Platzierung mehrerer Zellpopulationen und hat eine wesentlich bessere Auflösung als extrusionsbasierte Bioprinter (in der Größenordnung von Mikrometern)22,23. Darüber hinaus erfordert DPAC im Gegensatz zu ECM-basierten Strukturierungsverfahren wie dem Mikrokontaktdruck keine differentielle Haftung der verschiedenen Zelltypen auf einer ECM-beschichteten Oberfläche15,23. Es ist ideal für die Beantwortung von Fragen darüber, wie die Zusammensetzung eines Gewebes sein Verhalten beeinflusst, wie Zellen mehrere zelluläre und mikroumweltliche Hinweise integrieren, wenn sie Entscheidungentreffen 6,29, und wie Zellpaare miteinander interagieren. Ein Vorteil dieser Methode gegenüber anderen Mikrostrukturierungsmethoden besteht darin, dass sie für die 3D-Zellkultur in einer einzigen Bildgebungsebene verwendet werden kann, was Zeitrafferstudien der Gewebeselbstorganisation und der Organoidmorphogeneseermöglicht 23,27,30.
Trotz dieser Vorteile erforderte die erfolgreiche Implementierung von DPAC die Synthese von kundenspezifischen Oligonukleotidreagenzien und den Zugang zu spezialisierten Geräten für die DNA-Musterung23,24, was die breite Akzeptanz einschränkte. Zum Beispiel müssen die optimalen lipidmodifizierten Oligos (LMOs), die im ursprünglichen Protokoll verwendet werden, kundenspezifisch synthetisiert, mit Lignocerinsäure oder Palmitinsäure modifiziert und gereinigtwerden 26. Dieser Prozess erfordert die Verwendung eines DNA-Synthesizers und eines Hochleistungsflüssigkeitschromatographiegeräts sowie den Kauf der zugehörigen Reagenzien wie Methylamin, einer kontrollierten Substanz, die sowohl institutionellen als auch bundesstaatlichen Vorschriften unterliegt. Alternativ können LMOs in großen Mengen individuell erworben werden, was jedoch eine erhebliche Vorabinvestition in die Technologie erfordert.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir eine überarbeitete Version von DPAC entwickelt, die kommerziell erhältliche cholesterinmodifizierte Oligos (CMOs) anstelle der kundenspezifisch synthetisierten LMOs verwendet. Um die Kosten weiter zu senken und die Flexibilität der Plattform zu erhöhen, haben wir auf ein modulares Drei-Oligo-System umgestellt. Anstatt für jede einzelne Zellpopulation ein neues cholesterinmodifiziertes Oligo zu bestellen, kann ein Benutzer dieses Protokolls stattdessen für jede Zellpopulation die gleichen cholesterinmodifizierten Oligos (“Universal Anchor” und “Universal Co-Anchor”) verwenden und dann ein kostengünstiges, unverändertes Oligo (“Adapter Strand”) verwenden, das sowohl mit dem Universal Anchor als auch entweder mit der aminfunktionalisierten DNA auf der Oberfläche oder dem Adapterstrang eines anderen Zelltyps hybridisiert.
Eine weitere Einschränkung des ursprünglichen DPAC-Protokolls bestand darin, dass es die DNA-gemusterten Dias mit einem hochauflösenden Flüssigkeitsdrucker (z. B. Nano eNabler, BioForce Nanosciences)erstellte 23,24. Obwohl dieses Instrument eine außergewöhnliche Auflösung und geringe Reagenzienanforderungen aufweist, ist es für die meisten Institutionen nicht verfügbar und hat eine relativ niedrige Druckrate (ca. 1 Merkmalsmuster pro Sekunde). Vor kurzem wurden zwei photolithographische Methoden entwickelt, um DNA-Merkmale auf Oberflächen zu strukturieren. Viola und Kollegen verwendeten eine Polyacrylamid- und Benzophenonbeschichtung, die einzelsträngige DNA-Oligos bei Exposition gegenüber UV-Licht kovalent bindet30. Mit dieser Methode konnten sie Gewebegerüste herstellen, die durch Zellkontraktilität und Selbstorganisation großflächige, programmierte Formveränderungen erfuhren. Scheideler et al. entwickelten eine Methode, die die UV-Belichtung eines positiven Fotolacks nutzt, um aminmodifizierte DNA-Oligos selektiv einem Aldehyd-funktionalisierten Objektträger29auszusetzen. Nach dem Backen und der reduktiven Aminierung wird die aminmodifizierte DNA kovalent an die Oberfläche gebunden. Diese Methode wurde verwendet, um die Reaktion adulter neuraler Stammzellen auf räumlich dargestellte Selbsterneuerungs- und Differenzierungshinweise zu untersuchen. Dieser Artikel passt das Protokoll von Scheideler et al. an, um die DNA-Muster zu erstellen, die CMO-markierte Zellen erfassen. Dieses Fotomusterungsprotokoll kann ohne Verwendung eines Reinraums durchgeführt werden. Es verwendet kostengünstige und handelsübliche Geräte, die leicht auf einem Tisch oder Abzug eingesetzt werden können. Die Verwendung von kostengünstigen oder DIY-Photolithographiegeräten (Do-it-yourself) erhöht die Zugänglichkeit für Forscher ohne Zugang zu Reinraumeinrichtungen und ermöglicht es den Forschern, die Technik ohne großen Zeit- oder Ressourcenaufwand auszuprobieren31,32. Eine bessere Auflösung und die Ausrichtung mehrerer DNA-Merkmale kann jedoch durch die Verwendung des kommerziellen Spin coaters und Mask Aligners erreicht werden, die üblicherweise in Reinraumeinrichtungen zu finden sind.
Hier beschreiben wir eine Methode, um Zellen mit Einzelzellauflösung mittels DNA-basierter Adhäsion zu mustern. Zunächst wird die Fotostrukturierung mit einem positiven Fotolack verwendet, um hochauflösende Muster von aminmodifizierter DNA auf einem aldehydmodifizierten Glassubstrat zu erzeugen. Als Nächstes wird die Folie behandelt, um die unspezifische Zellanheftung zu reduzieren, und PDMS-Flusszellen werden erstellt, um Zellen über strukturierte Bereiche einzugrenzen. Zellen werden dann mit kurzen DNA-Oligonukleotiden markiert, die mit Cholesterin funktionalisiert werden und dadurch in die Zellmembran eingebracht werden. Die Zellen werden dann über die DNA-Mikromuster geflossen. Die Hybridisierung zwischen der Zelloberflächen-DNA und der DNA auf der Glasoberfläche führt zu einer spezifischen Adhäsion der Zellen an das DNA-Muster. Nicht adhärente Zellen werden weggewaschen, wodurch das adhärente Zellmuster enthüllt wird. Dieser Vorgang kann wiederholt werden, um mehrere Zelltypen zu strukturieren oder mehrschichtige Strukturen zu erzeugen. Auf Wunsch können die Zellen vollständig in ein ECM für die 3D-Zellkultur eingebettet werden.
In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll für die hochauflösende Musterung von Zellen in 2D und 3D für In-vitro-Zellkulturexperimente vor. Im Gegensatz zu zuvor veröffentlichten Versionen dieser Methode konzentriert sich das hier vorgestellte Protokoll auf die Benutzerfreundlichkeit: Es erfordert keine hochspezialisierte Ausrüstung und alle Reagenzien können von Anbietern gekauft werden, anstatt eine kundenspezifische Synthese zu erfordern. Im Gegensatz zu anderen Zellmikrostrukturierungsmethoden ist diese Methode schnell und zelltypunabhängig: Sie erfordert keine spezifische Adhäsion an extrazellulären Matrixproteinen15. Durch CMO-DPAC gemusterte Zellen können in eine extrazelluläre Matrix wie Matrigel oder Kollagen eingebettet werden, was zu 3D-Kulturen mit viel höherer räumlicher Auflösung führt, als dies derzeit mit extrusionsdruckbasierten Verfahren möglich ist22. CMO-DPAC kann verwendet werden, um Hunderte bis Tausende von mikroskopischen Merkmalen pro Objektträger zu erzeugen, so dass viele Replikate gleichzeitig durchgeführt werden können.
Einer der wichtigsten Parameter für den Erfolg dieses Protokolls ist die Dichte der Zellen, die den Flusszellen auf dem gemusterten Objektträger hinzugefügt werden. Idealerweise sollte die Dichte mindestens 25 Millionen Zellen / ml betragen. Beim Laden in die Durchflusszellen führt diese Zelldichte zu einer nahezu dicht gepackten Monoschicht von Zellen über dem Muster (Ergänzende Abbildung 2B). Diese hohen Zelldichten maximieren die Wahrscheinlichkeit, dass sich eine Zelle direkt auf einem DNA-Punkt absetzt und anhaftet. Die Verringerung der Zelldichte verringert die Gesamtstrukturierungseffizienz. Ein weiterer kritischer Schritt in diesem Protokoll ist die gründliche Erneute Suspendierung der Zellen in PBS- oder serumfreien Medien vor Zugabe der CMO-Lösung. Die CMOs teilen sich sehr schnell in Zellmembranen auf und die Zugabe der CMO-Lösung direkt zu einem Zellpellet führt zu einer heterogenen Markierung der Zellen. Nach Zugabe der CMO-Lösung zur Zellsuspension ist es wichtig, gründlich durch Pipettieren zu mischen, damit die Zellen gleichmäßig mit den CMOs gekennzeichnet sind. Nach den Inkubationen ist es notwendig, die überschüssigen CMOs durch mehrere Zentrifugations- und Waschschritte gründlich auszuwaschen. Überschüssiges freies CMO, das in der Zellsuspension vorhanden ist, bindet an die gemusterte aminmodifizierte DNA auf dem Glasobjektträger und blockiert die Hybridisierung und Adhäsion der CMO-modifizierten Zellen in suspension. Zeit ist auch eine wichtige Überlegung für dieses Protokoll. Es ist wichtig, bei der Verwendung von CMOs so schnell wie möglich zu arbeiten und die Zellen auf Eis zu halten, um die Internalisierung der CMOs zu minimieren und die Lebensfähigkeit der Zellen zu maximieren. Durchflusszytometrie-Experimente haben gezeigt, dass CMOs nicht so lange auf der Zelloberfläche persistieren wie LMOs, mit 25% Verlust von CMO-Komplexen über zwei Stunden Inkubation auf Eis36. Darüber hinaus nimmt die Lebensfähigkeit der Zellen mit zunehmender Zellhandhabungszeit ab. Die Lebensfähigkeit kann maximiert werden, indem schnell gearbeitet wird, Zellen auf Eis gehalten werden, eiskalte Reagenzien verwendet werden und serumfreie Medien verwendet werden, um einige Nährstoffe bereitzustellen.
Obwohl CMO-DPAC eine leistungsstarke Möglichkeit sein kann, die Zellbiologie zu untersuchen, indem Zellen mit hoher Präzision strukturiert werden, hat es seine Grenzen. CMO-DPAC-Experimente können eine Herausforderung darstellen, zumal die experimentelle Komplexität mit mehreren Zelltypen, Schichten oder 3D-Zellkulturen hinzugefügt wird (Supplemental File 1). Experimentelle Fehler können beim Starten dieses Protokolls häufig auftreten, wie in Tabelle 1beschrieben. Daher empfehlen wir den Benutzern, Qualitätskontrollen durchzuführen (Bestätigung, dass DNA auf dem Objektträger vorhanden ist, Bestätigung, dass Zellen ausreichend mit DNA markiert sind (Schritt 8), Bestätigung, dass überschüssige Zellen gründlich weggewaschen wurden usw.), um sicherzustellen, dass das Experiment erfolgreich ist und Schritte zu identifizieren, die möglicherweise eine weitere Optimierung erfordern. Wir hoffen, dass die in diesem Manuskript und seinen ergänzenden Dateien enthaltenen Informationen dazu beitragen werden, die erforderliche Fehlerbehebung zu erleichtern.
Cholesterin ist ein bioaktives Molekül, dessen Internalisierung den Zellstoffwechsel, die Genexpression und die Membranfluidität beeinflussen kann37,38. Eine frühere Studie verglich die Auswirkungen auf die Genexpression von CMO- und LMO-markierten Zellen mittels Einzelzell-RNA-Sequenzierung. CMO-markierte HEK-Zellen hatten eine veränderte Genexpression im Vergleich zu nicht markierten und LMO-markierten Zellen36. Die Markierung von Zellen mit CMOs führte zur differentiellen Expression (> 1,5-fachen) von acht Genen im Vergleich zu nicht markierten Kontrollen, einschließlich AP2B1, das mit Cholesterin und Sphingolipidentransport (GeneCards) in Verbindung gebracht wurde, und MALAT1, einer langen nicht-kodierenden RNA, die die Cholesterinakkumulation reguliert39. Obwohl diese transkriptionellen Reaktionen geringfügig sind, können sie dennoch von Belang sein, wenn das betreffende Experiment den Stoffwechsel, die Membrandynamik oder andere cholesterinassoziierte Signalwege in Zellen untersucht.
Dieses Protokoll ist flexibel und kann an die Anforderungen jedes Experiments angepasst werden. Da sich der CMO in die Lipidmembran einfügt, anstatt einen spezifischen Rezeptor zu verwenden, ist die Methode zelltypunabhängig (HUVECs, MCF10As, HEKs und MDCKs wurden hier demonstriert). Obwohl Cholesterin ein anderer hydrophober Anker ist als unsere zuvor veröffentlichten LMOs, haben wir bisher festgestellt, dass sie sich ähnlich verhalten. Daher würden wir erwarten, dass die CMOs mit einer Der Vielzahl von Zelltypen arbeiten, die wir zuvor mit LMOs veröffentlicht haben, einschließlich, aber nicht beschränkt auf neurale Stammzellen, Fibroblasten, periphere mononukleäre Blutzellen, Tumorzellen und primäre Brustepithelzellen6,23,27,29,36 . Die CMO-Markierung stimuliert TLR9 nicht, was darauf hindeutet, dass das Protokoll mit Immunzellen kompatibel ist. Der Membraneinbau des CMO ist eine Funktion der Gesamtzellgröße und des Grades der negativen Ladung in der Zelle Glykokalyx35. Daher haben wir ein Protokoll (Schritt 8) zum Testen des Ausmaßes der Membraneinarbeitung aufgenommen, das für eine schnelle Optimierung geeignet ist. Die spezifischen Merkmale jedes Zellmusters variieren zwangsläufig je nach experimentellem Design (siehe Ergänzende Datei 1 für weitere Anleitungen). Obwohl das oben beschriebene Photomusterungsprotokoll zur Strukturierung der DNA empfohlen wird, sollte jede Methode zur räumlichen Eingrenzung von Tröpfchen der Amin-DNA-Lösung funktionieren, wie z.B. die Verwendung von hochauflösenden Tröpfchendruckern. Die Musterauflösung und der minimale Feature-Abstand variieren je nach verwendeter Methode. Es ist theoretisch auch möglich, die DNA-Photostrukturierungsabschnitte dieses Protokolls mit anderen Methoden zu kombinieren, die verwendet wurden, um Zellen mit DNA zu markieren, wie z.B. mit DNA, die zu membranexprimierten Zinkfingern hybridisiert ist40, unter Verwendung von NHS-konjugierter DNA41und reagierender Azido-Sialinsäurereste auf der Zelloberfläche mit Phosphin-konjugierter DNA42 . CMO-DPAC kann auf eine Vielzahl von Experimenten angewendet werden, die eine strenge Kontrolle über den Zellabstand erfordern, einschließlich Studien der Wechselwirkungen zwischen Zellpaaren, Kokulturexperimente, die die Übertragung von Signalen von “Sender”-Zellen auf “Empfänger”-Zellen untersuchen, und Untersuchungen der Wirkung von nahe gelegenen extrazellulären Hinweisen auf die Stammzelldifferenzierung6,29 . Die Methode kann auch verwendet werden, um Mikrogewebe zu erzeugen, mit denen die Zellmigration in drei Dimensionen, die Selbstorganisation von Zellen in Gewebe23,27und das dynamische Zusammenspiel zwischen Zellen und dem ECM27untersucht werden können. Wir hoffen, dass dieses Protokoll den Forschern eine zugängliche Plattform bietet, um neue Anwendungen der hochauflösenden DNA-basierten Zellstrukturierung in ihren eigenen Labors zu erforschen.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken Jeremy Garcia für das Testen dieses Protokolls und Bhushan Kharbikar für die Schulung der Ausrüstung am UCSF Biomedical Micro and Nanotechnology Core. Diese Forschung wurde zum Teil durch Zuschüsse des Department of Defense Breast Cancer Research Program (W81XWH-10-1-1023 und W81XWH-13-1-0221), NIH (U01CA199315, DP2 HD080351-01, 1R01CA190843-01, 1R21EB019181-01A und 1R21CA182375-01A1), der NSF (MCB1330864) und des UCSF Center for Cellular Construction (DBI-1548297), einem NSF Science and Technology Center, unterstützt. O.J.S wurde durch ein NSF Graduate Research Fellowship, ein Siebel-Stipendium und ein P.E.O.-Stipendium finanziert. Z.J.G und A.R.A. sind Chan-Zuckerberg BioHub Investigators.
2-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | Thermo Fisher Scientific | 155379 | |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Adapter with External SM1 Threads and Internal SM3 Thread | ThorLabs | SM3A1 | |
Aldehyde Functionalized Slides | Schott | Nexterion Slide AL | Store under dry conditions after opening. |
All Plastic Syringes, 1 mL | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
Amine-Modified DNA Oligo | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
Aspheric Condenser Lens | ThorLabs | ACL7560 | |
Borosilicate Disc, 6in Diameter X 1/2in Thick | Chemglass | CG-1906-23 | |
Cell Culture Dishes 60×15 mm style | Corning | 353002 | |
Cholesterol-Modified Oligo | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
Diamond Scribe | Excelta | 475B | |
DNA Oligonucleotide | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | |
Isopropyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | |
Methylene Chloride (Stabilized/Certified ACS) | Fisher Scientific | D37-4 | |
MF-321 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | |
Microposit S1813 Positive Photoresist | Kayaku Advanced Materials | n/a | |
Ø3" Adjustable Lens Tube, 0.81" Travel | ThorLabs | SM3V10 | |
Oven | Thermo Scientific | 51-028-112H | |
PE-50 Compact Benchtop Plasma Cleaning System | Plasma Etch | PE-50 | |
Photomask (custom) | CAD/Art Services | n/a | Minimum feature size guaranteed by CAD/Art Services is 10 microns. |
Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
RCT Basic Hot Plate | IKA | 3810001 | |
Silicon Wafer (100 mm) | University Wafer | 590 | |
Sodium Borohydride, 98%, granules | Acros Organics | 419471000 | |
Spin Coater Kit | Instras | SCK-200 | This is a low cost option, but any spin coater that can maintain a speed of 3000 rpm will suffice. |
SU-8 2075 | Microchem | Y111074 0500L1GL | |
SU-8 Developer | Microchem | Y020100 4000L1PE | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 2646340 | |
Syringe Needles | Sigma-Aldrich | Z192341 | |
T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current | ThorLabs | LEDD1B | |
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl dimethylchlorosilane | Gelest | SIT8170.0 | |
Triethylamine | Sigma-Aldrich | 90335 | |
Turbo DNase | Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
Tweezers Style N7 | VWR | 100488-324 | The curved shape of these tweezers is essential for delicately picking up the PDMS flow cells containing patterned tissues. |
UV LED (365 nm, 190 mW (Min) Mounted LED, 700 mA) | ThorLabs | M365L2 | |
Wafer Tweezers | Agar Scientific | T5063 | |
WHEATON Dry-Seal vacuum desiccator | Millipore Sigma | W365885 |