Здесь мы представляем протокол к микропаттерновым клеткам с одноклеточным разрешением с использованием днк-запрограммированной адгезии. Этот протокол использует настольная фотолитографическую платформу для создания паттернов олигонуклеотидов ДНК на стеклянном слайде, а затем маркирует клеточные мембраны коммерчески доступными комплементарными олигонуклеотидами. Гибридизация олиго приводит к запрограммированной клеточной адгезии.
Относительное расположение клеток является ключевой особенностью микросреды, организующей клеточно-клеточные взаимодействия. Для изучения взаимодействий между клетками одного или другого типа оказались полезными методы микроструктурирования. ДНК-запрограммированная сборка клеток (DPAC) – это метод микроструктурирования, который нацелен на адгезию клеток к субстрату или другим клеткам с использованием гибридизации ДНК. Самые основные операции в DPAC начинаются с украшения клеточных мембран липид-модифицированными олигонуклеотидами, а затем протекают ими по субстрату, который был узорчат с комплементарными последовательностями ДНК. Клетки избирательно прилипают к субстрату только там, где они находят комплементарную последовательность ДНК. Неприлипанные клетки смываются, выявляя рисунок адгезивных клеток. Дополнительные операции включают дальнейшие раунды клеточного субстрата или клеточно-клеточной адгезии, а также перенос паттернов, образованных DPAC, во встраиваемый гидрогель для долгосрочной культуры. Ранее методы моделирования олигонуклеотидов на поверхностях и украшения клеток последовательностями ДНК требовали специализированного оборудования и пользовательского синтеза ДНК соответственно. Мы сообщаем об обновленной версии протокола, использующей недорогую настольной фотолитографическую установку и коммерчески доступные модифицированные холестерином олигонуклеотиды (ОКУ), развернутые с использованием модульного формата. Клетки, меченые CMO, с высокой эффективностью прилипают к субстрастрам с ДНК-паттернами. Этот подход может быть использован для создания нескольких типов клеток одновременно с высокой точностью и для создания массивов микротизюй, встроенных во внеклеточный матрикс. Преимущества этого метода включают его высокое разрешение, способность встраивать клетки в трехмерную микросреду без нарушения микроструктуры и гибкость в паттерне любого типа клеток.
Расположение клеток относительно друг друга в ткани является важной особенностью микросреды1,2,3,4. Методы, используемые для структурирования живых клеток в пространственно контролируемые расположения, являются ценными экспериментальными инструментами дляизучения дифференцировки4,5,6,7,8,подвижности клеток9,морфогенеза10, 11, 12,метаболизма13и клеточно-клеточных взаимодействий7,14 . Существует множество методов паттернирования клеток, каждый со своими преимуществами и недостатками3,4. Методы, которые создают адгезивные островки из белков внеклеточного матрикса (ECM), такие как микроконтактная печать и лазерная резка трафаретов, просты и масштабируемы. Тем не менее, трудно создать паттерн более одного или двух типов клеток одновременно, потому что адгезивные свойства разных типов клеток к различным молекулам ECM часто похожи15,16,17. Более сложные микроструктуры могут быть созданы с помощью световой молекулярной адсорбции (LIMAP), метода, который использует ультрафиолетовый свет для абляции областей, покрытых ПЭГ, и допускает последующую адсорбцию белка18,19. Этот процесс может быть повторен для создания микроструктур с высоким разрешением с несколькими типами клеток. Однако может произойти перекрестное связывание клеток с различными белковыми пятнами, что приводит к плохой специфичности паттерна19. Физические методы, такие как посев клеток на микромеханические реконфигурируемые устройства культивирования, могут создавать структурированные кокультуры с динамическим управлением, но без гибкости в дизайне шаблонов микроконтактной печати или LIMAP14,8. В отличие от других методов, биопечать может создавать трехмерные расположения клеток внутри гидрогелей20,21. Тем не менее, биопечатные конструкции имеют гораздо более низкое разрешение, чем другие методы микроструктурирования, со средним размером признака порядка сотен микрон22. Идеальный метод клеточного паттерна должен иметь высокое разрешение, шаблонировать несколько типов клеток, использовать оборудование и реагенты, которые легко доступны, и иметь возможность встраивать успешные паттерны в гидрогель для трехмерной (3D) клеточной культуры. В этой статье мы представляем CMO-DPAC, метод микроструктурирования клеток, который использует гибкость и скорость гибридизации ДНК для нацеливания клеточной адгезии к субстрату. Этот метод был адаптирован из наших предыдущих протоколов23,24, чтобы сделать его более доступным, модульным и доступным. Используя текущий протокол, любая лаборатория должна иметь возможность настроить полностью функциональную систему без какого-либо специализированного оборудования или опыта.
ЗАПРОГРАММИРОВАННАЯ сборка клеток ДНК (DPAC) – это мощная техника тканевой инженерии, которая моделирует клетки с одноклеточным разрешением с точным контролем расстояния между клетками и геометрией тканей. В DPAC клеточные мембраны украшены олигонуклеотидами ДНК (олиго) с использованием двух липид-модифицированных олиго, предназначенных для гибридизации на клеточной мембране. Поскольку олиго конъюгированы с гидрофобными липидами, они быстро переходят на клеточную мембрану25, где они гибридизуются, увеличивая чистую гидрофобность нековалентно связанных молекул и тем самым увеличивая их время жизни на поверхности клетки26. Олиго представлены на поверхности клетки таким образом, что они могут гибридизоваться с комплементарными олиго на других клетках или ДНК-функционализированными стеклянными слайдами для создания определенных 2D или 3D клеточных паттернов с предписанным составом, расстоянием между клетками и геометрией23,24. Узорчатые микротизры могут быть отщеплены от поверхности ферментаматически и встроены в гидрогель для длительной 3D-культуры. При использовании в сочетании с первичными клетками или стволовыми клетками полученные коллекции клеток могут подвергаться морфогенезу и формироваться в органоиды23,27,28. DPAC был применен для исследования динамики судьбы взрослых нервных стволовых клеток в ответ на конкурирующие сигналы6,29,для изучения самоорганизации эпителиальных клеток молочной железы23, 28и для генерации «тканевого оригами» посредством мезенхимальной конденсации27.
DPAC позволяет точно размещать несколько клеточных популяций и имеет значительно лучшее разрешение, чем биопринтеры на основе экструзии (порядка микрон)22,23. Кроме того, в отличие от методов моделирования на основе ECM, таких как микроконтактная печать, DPAC не требует дифференциальной адгезии различных типов клеток к поверхности с покрытием ECM15,23. Он идеально подходит для ответа на вопросы о том, как состав ткани влияет на ее поведение, как клетки интегрируют несколько клеточных и микроокружающих сигналов при принятиирешений 6,29и как пары клеток взаимодействуют друг с другом. Преимущество этого метода перед другими методами микроструктурирования заключается в том, что его можно использовать для 3D-культуры клеток в одной плоскости визуализации, облегчая покадровые исследования самоорганизации тканей и органоидного морфогенеза23,27,30.
Несмотря на эти преимущества, успешное внедрение DPAC потребовало синтеза пользовательских олигонуклеотидных реагентов и доступа к специализированному оборудованию для паттернов ДНК23,24,что ограничивает широкое распространение. Например, оптимальные липид-модифицированные олиго (ЖИО), используемые в исходном протоколе, должны быть специально синтезированы, модифицированы лигноцериновой кислотой или пальмитиновой кислотой и очищены26. Этот процесс требует использования синтезатора ДНК и высокоэффективного инструмента жидкостной хроматографии, а также покупки связанных реагентов, таких как метиламин, контролируемое вещество, которое подпадает как под институциональные, так и федеральные правила. В качестве альтернативы ЖИО могут быть приобретены на заказ оптом, но это требует значительных авансовых инвестиций в технологию.
Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали пересмотренную версию DPAC, которая использует коммерчески доступные модифицированные холестерином олиго (ОКУ) вместо специально синтезированных ЖИО. Чтобы еще больше снизить затраты и повысить гибкость платформы, мы перешли на модульную трехолигосистему. Вместо того, чтобы заказывать новое модифицированное холестерином олиго для каждой уникальной клеточной популяции, пользователь этого протокола может вместо этого использовать одни и те же модифицированные холестерином олиго («Универсальный якорь» и «Универсальный ко-якорь») для каждой клеточной популяции, а затем использовать недорогое, немодифицированное олиго («Adapter Strand»), которое гибридизуется как с универсальным якорем, так и либо с амино-функционализированной ДНК на поверхности, либо с переходной нитью другого типа клеток.
Другим ограничением оригинального протокола DPAC было то, что он создавал слайды с днк-паттернами с помощью жидкого принтера с высоким разрешением (например, Nano eNabler, BioForce Nanosciences)23,24. Хотя этот прибор может похвастаться исключительным разрешением и низкими требованиями к реагентам, он недоступен для большинства учреждений и имеет относительно низкую скорость печати (примерно 1 функция с рисунком в секунду). Недавно были разработаны два фотолитографических метода для моделирования особенностей ДНК на поверхностях. Виола и его коллеги использовали полиакриламидное и бензофенонное покрытие, которое ковалентно связывает одноцепочечные олиго ДНК при воздействии ультрафиолетового света30. Используя этот метод, они смогли создать тканевые каркасы, которые претерпели крупномасштабные, запрограммированные изменения формы в результате сократимости клеток и самоорганизации. Scheideler et al. разработали метод, который использует УФ-экспозицию положительного фоторезиста для селективного воздействия амино-модифицированных олиго ДНК на альдегидно-функционализированный слайд29. После выпечки и восстановительного аминирования амино-модифицированная ДНК ковалентно связывается с поверхностью. Этот метод был использован для исследования реакции взрослых нервных стволовых клеток на пространственно представленные сигналы самообновления и дифференцировки. Эта статья адаптирует протокол Scheideler et al. для создания паттернов ДНК, которые будут захватывать клетки, меченые CMO. Этот протокол фотопаттерна может быть выполнен без использования чистой комнаты. Он использует недорогое и коммерчески доступное оборудование, которое легко развертывается на столешнице или вытяжном капоте. Использование недорогого или DIY (сделай сам) фотолитографического оборудования повышает доступность для исследователей без доступа к объектам чистых помещений и позволяет исследователям попробовать технику без больших вложений времени или ресурсов31,32. Тем не менее, лучшее разрешение и выравнивание нескольких признаков ДНК могут быть достигнуты с помощью коммерческого спин-коатера и элайнера масок, обычно встречающихся в чистых помещениях.
Здесь мы описываем метод паттернирования клеток с одноклеточным разрешением с использованием адгезии на основе ДНК. Во-первых, фотопаттернирование с положительным фоторезистом используется для создания паттернов с высоким разрешением амино-модифицированной ДНК на альдегидно-модифицированной стеклянной подложке. Затем слайд обрабатывается для уменьшения неспецифического прикрепления клеток, а ячейки потока PDMS создаются для ограничения клеток над узорчатыми областями. Затем клетки мечутся короткими олигонуклеотидами ДНК, которые функционализируются холестерином и в результате вставляются в клеточную мембрану. Затем клетки протекают по микроструктурам ДНК. Гибридизация между ДНК клеточной поверхности и ДНК на поверхности стекла приводит к специфической адгезии клеток к образцу ДНК. Неприлипание клеток смывается, выявляя адгезивный клеточный паттерн. Этот процесс может быть повторен для создания шаблонов нескольких типов клеток или для создания многослойных структур. При желании клетки могут быть полностью встроены в ECM для 3D клеточной культуры.
В этой статье мы представляем подробный протокол для паттернов клеток с высоким разрешением в 2D и 3D для экспериментов с культурой клеток in vitro. В отличие от ранее опубликованных версий этого метода, представленный здесь протокол фокусируется на удобстве использования: он не требует узкоспециализированного оборудования, и все реагенты могут быть приобретены у поставщиков вместо того, чтобы требовать пользовательского синтеза. В отличие от других методов микроструктурирования клеток, этот метод является быстрым и агностичным по клеточному типу: он не требует специфической адгезии к белкам внеклеточного матрикса15. Клетки, созданные CMO-DPAC, могут быть встроены во внеклеточный матрикс, такой как матригель или коллаген, что приводит к 3D-культурам с гораздо более высоким пространственным разрешением, чем это в настоящее время возможно с помощью методов экструзионной печати22. CMO-DPAC может быть использован для создания от сотен до тысяч микроскопических объектов на слайде, что позволяет одновременно выполнять множество реплик.
Одним из наиболее важных параметров успеха этого протокола является плотность клеток, добавленных к ячейкам потока поверх узорчатого слайда. В идеале плотность должна составлять не менее 25 миллионов клеток/мл. При загрузке в проточные ячейки эта плотность ячеек приводит к почти плотно упакованному монослою клеток над рисунком(дополнительный рисунок 2B). Эти высокие плотности клеток максимизируют вероятность того, что клетка поселится непосредственно на вершине пятна ДНК и прилипнет. Уменьшение плотности ячеек снизит общую эффективность паттернов. Другим важным шагом в этом протоколе является тщательная повторная приостановка клеток в PBS или средах, свободных от сыворотки, перед добавлением раствора CMO. ОКУ очень быстро делятся на клеточные мембраны, и добавление раствора CMO непосредственно к клеточной грануле приведет к гетерогенной маркировке клеток. После добавления раствора CMO в клеточную суспензию важно тщательно перемешать путем пипетирования, чтобы ячейки были равномерно помечены СХМО. После инкубации необходимо тщательно вымыть лишние ОКУ с помощью нескольких этапов центрифугирования и промывки. Избыток свободного ОКУ, присутствующий в клеточной суспензии, будет связываться с узорчатой амино-модифицированной ДНК на стеклянном слайде, блокируя гибридизацию и адгезию CMO-модифицированных клеток в суспензии. Время также является ключевым фактором для этого протокола. Важно работать как можно быстрее при использовании ОКУ и держать клетки на льду, чтобы свести к минимуму интернализацию ОКУ и максимизировать жизнеспособность клеток. Эксперименты по проточной цитометрии показали, что ОКУ не сохраняются так долго на поверхности клеток, как ЖИО, с потерей 25% комплексов ОКУ в течение двух часов инкубации нальду 36. Кроме того, жизнеспособность клеток будет уменьшаться по мере увеличения времени обработки клеток. Жизнеспособность может быть максимизирована путем быстрой работы, удержания клеток на льду, использования ледяных реагентов и использования безсывороточных сред для обеспечения некоторых питательных веществ.
Хотя CMO-DPAC может быть мощным способом изучения клеточной биологии путем паттернирования клеток с высокой точностью, у него есть свои ограничения. Эксперименты CMO-DPAC могут быть сложными, особенно потому, что экспериментальная сложность добавляется с несколькими типами клеток, слоями или 3D-культурой клеток(Дополнительный файл 1). Экспериментальные сбои могут быть распространены при запуске этого протокола, как описано в таблице 1. Поэтому мы рекомендуем пользователям проводить проверки качества (подтверждая, что ДНК присутствует на слайде, подтверждая, что клетки достаточно помечены ДНК (шаг 8), подтверждая, что избыточные клетки были тщательно смыты и т. Д.), Чтобы убедиться, что эксперимент удался, и определить шаги, которые могут потребовать дальнейшей оптимизации. Мы надеемся, что информация, представленная в этой рукописи и ее дополнительных файлах, поможет облегчить любые необходимые способы устранения неполадок.
Холестерин представляет собой биологически активную молекулу, интернализация которой может влиять на клеточный метаболизм, экспрессию генов и текучесть мембран37,38. В предыдущем исследовании сравнивали влияние на экспрессию генов клеток, меченых CMO и LMO, с использованием секвенирования одноклеточной РНК. Клетки HEK, меченые CMO, имели измененную экспрессию генов по сравнению с немаркированными и мечеными LMO клетками36. Маркировка клеток С помощью ОКУ привела к дифференциальной экспрессии (> в 1,5 раза) восьми генов относительно немаркированных контрольных органов, включая AP2B1, который был связан с транспортом холестерина и сфинголипида (GeneCards), и MALAT1, длинную некодирующую РНК, которая регулирует накопление холестерина39. Хотя эти транскрипционные реакции незначительны, они, тем не менее, могут вызывать беспокойство, если рассматриваемый эксперимент изучает метаболизм, динамику мембран или другие пути, связанные с холестерином, в клетках.
Этот протокол является гибким и может быть скорректирован в соответствии с потребностями каждого эксперимента. Поскольку CMO вставляет себя в липидную мембрану вместо использования какого-либо конкретного рецептора, метод является агностиком клеточного типа (ЗДЕСЬ были продемонстрированы HUVECs, MCF10As, HEKs и MDCK). Хотя холестерин является другим гидрофобным якорем, чем наши ранее опубликованные ЖИО, мы до сих пор обнаружили, что они ведут себя аналогично. Таким образом, мы ожидаем, что ОКУ будут работать с любым из широкого спектра типов клеток, которые мы ранее опубликовали с ЖИО, включая, но не ограничиваясь, нервными стволовыми клетками, фибробластами, мононуклеарными клетками периферической крови, опухолевыми клетками и первичными эпителиальными клетками молочной железы6,23,27,29,36 . Маркировка CMO не стимулирует TLR9, предполагая, что протокол совместим с иммунными клетками. Мембранное включение ОКУ является функцией общего размера клетки и степени отрицательного заряда в клетке гликокаликса35. Таким образом, мы включили протокол (шаг 8) для тестирования степени включения мембраны, которая поддаться быстрой оптимизации. Специфические особенности каждого клеточного паттерна неизбежно будут варьироваться в зависимости от экспериментального дизайна (см. Дополнительный файл 1 для получения дополнительного руководства). Хотя протокол фотопаттернирования, описанный выше для паттерна ДНК, рекомендуется, любой метод пространственного ограничения капель раствора амина-ДНК должен работать, например, использование капельных принтеров высокого разрешения. Разрешение шаблона и минимальный интервал между функциями зависят от используемого метода. Также теоретически возможно комбинировать ДНК-фотопаттерные участки этого протокола с другими методами, которые использовались для маркировки клеток с ДНК, например, с ДНК, гибридизированной с мембранно-экспрессированными цинковыми пальцами40,с использованием NHS-конъюгированной ДНК41и реагируя на остатки азидо сиаловой кислоты на поверхности клетки с фосфин-конъюгированной ДНК42. . CMO-DPAC может быть применен к различным экспериментам, которые требуют жесткого контроля над расстоянием между клетками, включая исследования взаимодействий между парами клеток, эксперименты с кокультурами, изучающие передачу сигналов от клеток-отправителей к клеткам-«приемникам», и исследования влияния близлежащих внеклеточных сигналов на дифференцировку стволовых клеток6,29 . Метод также может быть использован для создания микротизов, которые могут быть использованы для изучения миграции клеток в трех измерениях, самоорганизации клеток вткани 23,27и динамического взаимодействия между клетками и ECM27. Мы надеемся, что этот протокол предоставит исследователям доступную платформу для изучения новых применений клеточного паттерна на основе ДНК с высоким разрешением в их собственных лабораториях.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Джереми Гарсию за тестирование этого протокола и Бхушана Харбикара за обучение работе с оборудованием в UCSF Biomedical Micro and Nanotechnology Core. Это исследование было частично поддержано грантами Программы исследований рака молочной железы Министерства обороны (W81XWH-10-1-1023 и W81XWH-13-1-0221), NIH (U01CA199315, DP2 HD080351-01, 1R01CA190843-01, 1R21EB01918181-01A и 1R21CA182375-01A1), NSF (MCB1330864) и Центра клеточного строительства UCSF (DBI-1548297), научно-технического центра NSF. O.J.S финансировался стипендией NSF Graduate Research Fellowship, стипендией Siebel и стипендией P.E.O. Z.J.G и A.R.A. являются исследователями Chan-Zuckerberg BioHub.
2-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | Thermo Fisher Scientific | 155379 | |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Adapter with External SM1 Threads and Internal SM3 Thread | ThorLabs | SM3A1 | |
Aldehyde Functionalized Slides | Schott | Nexterion Slide AL | Store under dry conditions after opening. |
All Plastic Syringes, 1 mL | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
Amine-Modified DNA Oligo | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
Aspheric Condenser Lens | ThorLabs | ACL7560 | |
Borosilicate Disc, 6in Diameter X 1/2in Thick | Chemglass | CG-1906-23 | |
Cell Culture Dishes 60×15 mm style | Corning | 353002 | |
Cholesterol-Modified Oligo | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
Diamond Scribe | Excelta | 475B | |
DNA Oligonucleotide | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | |
Isopropyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | |
Methylene Chloride (Stabilized/Certified ACS) | Fisher Scientific | D37-4 | |
MF-321 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | |
Microposit S1813 Positive Photoresist | Kayaku Advanced Materials | n/a | |
Ø3" Adjustable Lens Tube, 0.81" Travel | ThorLabs | SM3V10 | |
Oven | Thermo Scientific | 51-028-112H | |
PE-50 Compact Benchtop Plasma Cleaning System | Plasma Etch | PE-50 | |
Photomask (custom) | CAD/Art Services | n/a | Minimum feature size guaranteed by CAD/Art Services is 10 microns. |
Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
RCT Basic Hot Plate | IKA | 3810001 | |
Silicon Wafer (100 mm) | University Wafer | 590 | |
Sodium Borohydride, 98%, granules | Acros Organics | 419471000 | |
Spin Coater Kit | Instras | SCK-200 | This is a low cost option, but any spin coater that can maintain a speed of 3000 rpm will suffice. |
SU-8 2075 | Microchem | Y111074 0500L1GL | |
SU-8 Developer | Microchem | Y020100 4000L1PE | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 2646340 | |
Syringe Needles | Sigma-Aldrich | Z192341 | |
T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current | ThorLabs | LEDD1B | |
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl dimethylchlorosilane | Gelest | SIT8170.0 | |
Triethylamine | Sigma-Aldrich | 90335 | |
Turbo DNase | Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
Tweezers Style N7 | VWR | 100488-324 | The curved shape of these tweezers is essential for delicately picking up the PDMS flow cells containing patterned tissues. |
UV LED (365 nm, 190 mW (Min) Mounted LED, 700 mA) | ThorLabs | M365L2 | |
Wafer Tweezers | Agar Scientific | T5063 | |
WHEATON Dry-Seal vacuum desiccator | Millipore Sigma | W365885 |