Aqui apresentamos um protocolo para células de micropattern em resolução unicelular usando a adesão programada pelo DNA. Este protocolo usa uma plataforma de fotolitografia benchtop para criar padrões de oligonucleotídeos de DNA em um slide de vidro e, em seguida, rotula membranas celulares com oligonucleotídeos complementares disponíveis comercialmente. A hibridização dos oligos resulta em adesão celularprogramada.
O posicionamento relativo das células é uma característica fundamental do microambiente que organiza interações célula-células. Para estudar as interações entre células do mesmo tipo ou diferentes, as técnicas de micropattering têm se mostrado úteis. DNA Programado Assembly of Cells (DPAC) é uma técnica de micropatterning que visa a adesão das células a um substrato ou outras células usando hibridização do DNA. As operações mais básicas no DPAC começam com a decoração de membranas celulares com oligonucleotídeos modificados por lipídios, depois fluindo-as sobre um substrato que foi padronizado com sequências complementares de DNA. As células aderem seletivamente ao substrato apenas onde encontram uma sequência complementar de DNA. Células não aderentes são lavadas, revelando um padrão de células aderentes. Operações adicionais incluem outras rodadas de substrato celular ou adesão celular, bem como a transferência dos padrões formados pelo DPAC para um hidrogel de incorporação para cultura de longo prazo. Anteriormente, métodos para padronizar oligonucleotídeos em superfícies e decorar células com sequências de DNA exigiam equipamentos especializados e síntese de DNA personalizada, respectivamente. Relatamos uma versão atualizada do protocolo, utilizando uma configuração de fotolitografia de bancada barata e oligonucleotídeos modificados de colesterol (CMOs) comercialmente disponíveis, implantados usando um formato modular. Células rotuladas por CMO aderem com alta eficiência a substratos padronizados pelo DNA. Essa abordagem pode ser usada para padronizar vários tipos de células ao mesmo tempo com alta precisão e para criar matrizes de microtissues incorporados dentro de uma matriz extracelular. As vantagens deste método incluem sua alta resolução, capacidade de incorporar células em um microambiente tridimensional sem interromper o micropattern, e flexibilidade na padronização de qualquer tipo de célula.
O posicionamento das células em relação umas às outras em um tecido é uma característica importante do microambiente1,2,3,4. Técnicas utilizadas para padronizar células vivas em arranjos espacialmente controlados são ferramentas experimentais valiosas para estudar a diferenciação4,5,6,7,8, motilidade celular9,morfogênese10,11,12, metabolismo13, e interações célula-células7,14 . Existem uma variedade de métodos para padronizar células, cada uma com suas próprias vantagens e desvantagens3,4. Métodos que criam ilhas adesivas de proteínas de matriz extracelular (ECM), como impressão de microcontatos e estêncil cortado a laser, são simples e escaláveis. No entanto, é difícil padronizar mais de um ou dois tipos de células por vez, pois as propriedades adesivas de diferentes tipos de células para diferentes moléculas de ECM são muitas vezes semelhantes15,16,17. Micropatterns mais complexos podem ser criados com adsorção molecular induzida pela luz (LIMAP), uma técnica que usa luz UV para ablatar regiões revestidas de PEG e permitir a adsorção de proteínas subsequente18,19. Esse processo pode ser repetido para criar micropatterns de alta resolução com vários tipos de células. No entanto, pode ocorrer a ligação cruzada das células com as diferentes manchas proteicas, resultando em má especificidade padrão19. Métodos físicos como a semeadura de células em dispositivos de cultura reconfiguráveis micromecânicas podem criar co-culturas estruturadas com controle dinâmico, mas sem a flexibilidade no design padrão de impressão de microcontatos ou LIMAP14,8. Ao contrário das outras técnicas, a bioimpressão pode criar arranjos tridimensionais de células dentro dos hidrogéis20,21. No entanto, os construtos bioimpressos têm resolução muito menor do que outras técnicas de micropatterning, com um tamanho médio de característica na ordem de centenas de mícrons22. Um método ideal de padronização celular teria alta resolução, padrão múltiplos tipos de células, usar equipamentos e reagentes que são facilmente acessíveis, e ter a capacidade de incorporar padrões bem sucedidos em um hidrogel para cultura celular tridimensional (3D). Neste artigo, apresentamos o CMO-DPAC, uma técnica de micropatterning celular que usa a flexibilidade e a velocidade da hibridização do DNA para direcionar a adesão celular a um substrato. Este método foi adaptado de nossos protocolos anteriores23,24 para torná-lo mais acessível, modular e acessível. Usando o protocolo atual, qualquer laboratório deve ser capaz de configurar um sistema totalmente funcional sem qualquer equipamento ou perícia especializada.
DNA Programado Assembly of Cells (DPAC) é uma poderosa técnica de engenharia de tecidos que padrona células em resolução unicelular com controle preciso sobre espaçamento celular e geometria tecidual. No DPAC, as membranas celulares são decoradas com oligonucleotídeos de DNA (oligos) usando dois oligos modificados por lipídio projetados para hibridizar na membrana celular. Como os oligos são conjugados a lipídios hidrofóbicos, eles rapidamente se particionam para a membrana celular25 onde hibridizam, aumentando a hidroofobidade líquida das moléculas não covalentemente ligadas, e assim aumentando sua vida útil na superfície celular26. Os oligos são apresentados na superfície celular de forma que podem hibridizar com oligos complementares em outras células ou lâminas de vidro funcionalizadas pelo DNA para criar padrões de células 2D ou 3D definidas com composição prescrita, espaçamento celular e geometria23,24. As microtissues padronizadas podem ser arrancadas da superfície enzimáticamente e incorporadas em um hidrogel para cultura 3D prolongada. Quando usadas em combinação com células primárias ou células-tronco, as coleções resultantes de células podem sofrer morfogênese e formar-se em organoides23,27,28. O DPAC tem sido aplicado para investigar a dinâmica do destino das células-tronco neurais adultas em resposta aos sinais concorrentes6,29, para estudar a auto-organização das células epiteliais mamárias23,28, e gerar “origami tecidual” através da condensação mesenquimal27.
O DPAC permite a colocação precisa de múltiplas populações celulares e tem resolução substancialmente melhor do que bioimpressoras baseadas em extrusão (na ordem dos mícrons)22,23. Além disso, ao contrário dos métodos de padronização baseados em ECM, como a impressão de microcontatos, o DPAC não requer adesão diferencial dos diferentes tipos de células a uma superfície revestida de ECM15,23. É ideal para responder perguntas sobre como a composição de um tecido afeta seu comportamento, como as células integram múltiplas pistas celulares e microambientais ao tomar decisões6,29, e como pares de células interagem entre si. Uma vantagem desse método em relação a outros métodos de micropatterning é que ele pode ser usado para a cultura celular 3D em um único plano de imagem, facilitando estudos de lapso de tempo da auto-organização tecidual e da morfogênese organoide23,27,30.
Apesar dessas vantagens, a implementação bem-sucedida do DPAC tem exigido a síntese de reagentes de oligonucleotídeos personalizados e o acesso a equipamentos especializados para padronização de DNA23,24, limitando a adoção generalizada. Por exemplo, os oligos modificados por lipídios (LMOs) usados no protocolo original devem ser sintetizados sob medida, modificados com ácido lignocerico ou ácido palmítico, e purificados26. Este processo requer o uso de um sintetizador de DNA e um instrumento de cromatografia líquida de alto desempenho, bem como a compra de reagentes associados, como a metilamina, substância controlada que está sujeita tanto às regulamentações institucionais quanto federais. Como alternativa, os LMOs podem ser comprados a granel, mas isso requer um investimento significativo na tecnologia.
Para superar essas limitações, desenvolvemos uma versão revisada do DPAC que utiliza oligos modificados pelo colesterol (CMOs) comercialmente disponíveis no lugar dos LMOs sintetizados sob medida. Para reduzir ainda mais os custos e aumentar a flexibilidade da plataforma, mudamos para um sistema modular de três oligo. Em vez de encomendar um novo oligo modificado pelo colesterol para cada população celular única, um usuário deste protocolo pode, em vez disso, usar os mesmos oligos modificados pelo colesterol (“Âncora Universal” e “Co-Âncora Universal”) para cada população celular e, em seguida, empregar um oligo barato e não modificado (“Adapter Strand”) que hibridiza tanto com a Âncora Universal quanto com o DNA funcionalizado amina na superfície ou o Adaptador Strand de outra célula.
Outra limitação do protocolo DPAC original foi que ele criou os slides padronizados em DNA usando uma impressora líquida de alta resolução (por exemplo, Nano eNabler, BioForce Nanosciences)23,24. Embora este instrumento tenha resolução extraordinária e baixos requisitos de reagente, ele não está disponível para a maioria das instituições e tem uma taxa de impressão relativamente baixa (aproximadamente 1 característica padronizada por segundo). Recentemente, dois métodos fotolithográficos foram desenvolvidos para padronizar características de DNA em superfícies. Viola e colegas usaram um revestimento de poliacrilamida e benzofenona que covalentemente amarrou oligos de DNA de fio único após a exposição à luz UV30. Usando este método, eles foram capazes de criar andaimes de tecido que sofreram mudanças de forma programadas em larga escala como resultado da contratude celular e da auto-organização. Scheideler et al. desenvolveram um método que usa exposição UV de um fotoresist positivo para expor seletivamente oligos de DNA modificados amina a um slide funcionalizado de aldeído29. Após assar e aminação redutiva, o DNA modificado por amina é covalentemente ligado à superfície. Este método foi utilizado para investigar a resposta de células-tronco neurais adultas a sinais de autoconexão e diferenciação que apresentavam espacialmente. Este artigo adapta o protocolo de Scheideler et al.para criar os padrões de DNA que capturarão células rotuladas por CMO. Este protocolo de fotopatterning pode ser realizado sem o uso de uma sala limpa. Ele usa equipamentos baratos e comercialmente disponíveis que são facilmente implantados em um banco ou capô de fumaça. O uso de equipamentos de fotolitografia barato ou DIY (faça você mesmo) aumenta a acessibilidade aos pesquisadores sem acesso a instalações limpas da sala e permite que os pesquisadores experimentem a técnica sem um grande investimento de tempo ou recursos31,32. No entanto, uma melhor resolução e o alinhamento de múltiplas características de DNA podem ser alcançados usando o revestimento de spin e o alinhador de máscaras comerciais comumente encontrados em instalações de limpeza.
Aqui, descrevemos um método para padronizar células em resolução unicelular usando a adesão baseada em DNA. Primeiro, fotopatterning com um fotoresist positivo é usado para criar padrões de alta resolução de DNA modificado por amina em um substrato de vidro modificado por aldeído. Em seguida, o slide é tratado para reduzir o apego celular não específico e as células de fluxo PDMS são criadas para limitar as células sobre regiões padronizadas. As células são então rotuladas com oligonucleotídeos de DNA curtos que são funcionalizados com colesterol e, como resultado, inserem na membrana celular. As células são então fluídas sobre os micropatterns de DNA. A hibridização entre o DNA da superfície celular e o DNA na superfície do vidro resulta em adesão específica das células ao padrão de DNA. Células não aderentes são lavadas, revelando o padrão celular aderente. Esse processo pode ser repetido para padronizar vários tipos de células ou para criar estruturas em várias camadas. Se desejar, as células podem ser totalmente incorporadas em um ECM para cultura celular 3D.
Neste artigo, apresentamos um protocolo detalhado para padronização de alta resolução de células em 2D e 3D para experimentos de cultura celular in vitro. Ao contrário das versões publicadas anteriormente deste método, o protocolo aqui apresentado foca na usabilidade: não requer equipamentos altamente especializados e todos os reagentes podem ser comprados de fornecedores em vez de exigir síntese personalizada. Ao contrário de outros métodos de micropattersão celular, este método é rápido e do tipo celular agnóstico: não requer adesão específica às proteínas da matriz extracelular15. As células padronizadas pelo CMO-DPAC podem ser incorporadas dentro de uma matriz extracelular, como Matrigel ou colágeno, resultando em culturas 3D com resolução espacial muito maior do que é atualmente possível com métodos baseados em impressão de extrusão22. O CMO-DPAC pode ser usado para criar centenas a milhares de recursos microscópicos por slide, permitindo que muitas réplicas sejam realizadas ao mesmo tempo.
Um dos parâmetros mais importantes no sucesso deste protocolo é a densidade de células adicionadas às células de fluxo em cima do slide padronizado. Idealmente, a densidade deve ser de pelo menos 25 milhões de células/mL. Quando carregada nas células de fluxo, essa densidade de células resulta em uma monocamada quase fechada de células acima do padrão(Figura Suplementar 2B). Essas altas densidades celulares maximizam a probabilidade de uma célula se estabelecer diretamente em cima de um ponto de DNA e aderir. Reduzir a densidade celular diminuirá a eficiência global de padronização. Outro passo crítico neste protocolo é suspender completamente as células em mídia PBS ou sem soro antes de adicionar a solução CMO. A partição cmos muito rapidamente em membranas celulares e adicionar a solução CMO diretamente a uma pelota celular resultará em rotulagem heterogênea de células. Depois de adicionar a solução CMO à suspensão da célula, é importante misturar-se completamente por pipetação para que as células sejam uniformemente rotuladas com os CMOs. Após as incubações, é necessário lavar completamente o excesso de CMOs através de múltiplas centrifugações e lavar passos. O CMO livre de excesso presente na suspensão celular se ligará ao DNA modificado por amina padronizado na lâmina de vidro, bloqueando a hibridização e a adesão das células modificadas pelo CMO em suspensão. O tempo também é uma consideração fundamental para este protocolo. É importante trabalhar o mais rápido possível ao usar CMOs e manter as células no gelo, a fim de minimizar a internalização dos CMOs e maximizar a viabilidade celular. Experimentos de citometria de fluxo mostraram que os CMOs não persistem tanto tempo na superfície celular quanto os LMOs, com perda de 25% dos complexos de CMO ao longo de duas horas de incubação no gelo36. Além disso, a viabilidade das células diminuirá à medida que o tempo de manuseio da célula aumenta. A viabilidade pode ser maximizada trabalhando rapidamente, mantendo células no gelo, usando reagentes gelados e usando mídia livre de soro para fornecer alguns nutrientes.
Embora o CMO-DPAC possa ser uma maneira poderosa de estudar biologia celular, padronizando células com alta precisão, ele tem suas limitações. Os experimentos do CMO-DPAC podem ser desafiadores, particularmente porque a complexidade experimental é adicionada com vários tipos de células, camadas ou cultura celular 3D(Arquivo Suplementar 1). Falhas experimentais podem ser comuns ao iniciar este protocolo, conforme descrito na Tabela 1. Por isso, recomendamos que os usuários instituam verificações de controle de qualidade (confirmando que o DNA está presente no slide, confirmando que as células são suficientemente rotuladas com DNA (Etapa 8), confirmando que o excesso de células foi completamente lavado, etc.) para garantir que o experimento tenha sucesso e identificar etapas que possam exigir maior otimização. Esperamos que as informações fornecidas neste manuscrito e seus arquivos suplementares ajudem a facilitar qualquer solução de problemas necessária.
O colesterol é uma molécula bioativa cuja internalização pode influenciar o metabolismo celular, a expressão genética e a fluidez da membrana37,38. Um estudo anterior comparou os efeitos na expressão genética de células rotuladas por CMO e LMO usando sequenciamento de RNA de célula única. As células HEK rotuladas por CMO alteraram a expressão genética em comparação com as células não rotuladas e rotuladas por LMO36. A rotulagem de células com CMOs resultou na expressão diferencial (> 1,5 vezes) de oito genes relativos a controles não rotulados, incluindo AP2B1, que tem sido ligado ao colesterol e ao transporte de sphingolipid (GeneCards), e MALAT1, um longo RNA não codificador que regula o acúmulo de colesterol39. Embora menores, essas respostas transcricionais podem, no entanto, ser preocupantes se o experimento em questão estiver estudando metabolismo, dinâmica de membrana ou outras vias associadas ao colesterol nas células.
Este protocolo é flexível e pode ser ajustado para atender às necessidades de cada experimento. Como o CMO se insere na membrana lipídica em vez de usar qualquer receptor específico, o método é agnóstico do tipo celular (HUVECs, MCF10As, HEKs e MDCKs foram demonstrados aqui). Embora o colesterol seja uma âncora hidrofóbica diferente dos nossos LMOs publicados anteriormente, até agora descobrimos que eles se comportam da mesma forma. Assim, esperamos que os CMOs trabalhem com qualquer uma das grandes variedades de tipos celulares que já publicamos anteriormente com LMOs, incluindo, mas não se limitando a células-tronco neurais, fibroblastos, células mononucleares de sangue periféricos, células tumorais e células epiteliais mamárias primárias6,23,27,29,36 . A rotulagem CMO não estimula o TLR9, sugerindo que o protocolo é compatível com células imunes. A incorporação da membrana do CMO é uma função do tamanho total da célula e do grau de carga negativa na célula glicocalyx35. Assim, incluímos um protocolo (Passo 8) para testar a extensão da incorporação da membrana que é favorável à rápida otimização. As características específicas de cada padrão celular inevitavelmente variam de acordo com o design experimental (consulte Arquivo Suplementar 1 para obter mais orientação). Embora o protocolo de fotopatterning descrito acima para padronização do DNA seja recomendado, qualquer método de confinar espacialmente gotículas de solução de DNA de amina deve funcionar, como o uso de impressoras de gotícula de alta resolução. A resolução do padrão e o espaçamento mínimo do recurso variam de acordo com o método utilizado. Também é teoricamente possível combinar as seções de fotopatterning de DNA deste protocolo com outros métodos que têm sido usados para rotular células com DNA, como com DNA hibridizado aos dedos de zinco expressos em membrana40,usando DNA conjugado pelo NHS41,e reagendo resíduos de ácido sálico na superfície celular com DNA conjugado por fosfina42 . O CMO-DPAC pode ser aplicado a uma variedade de experimentos que requerem controle rigoroso sobre o espaçamento celular-célula, incluindo estudos das interações entre pares de células, experimentos de co-cultura olhando para a transferência de sinais de células “remetentes” para células “receptoras” e investigações do efeito de pistas extracelulares próximas na diferenciação de células-tronco6,29 . O método também pode ser usado para criar microtissues que podem ser usados para estudar a migração celular em três dimensões, a auto-organização das células nos tecidos23,27, e a interação dinâmica entre as células e o ECM27. Esperamos que este protocolo forneça aos pesquisadores uma plataforma acessível para explorar novas aplicações de padronização celular baseada em DNA de alta resolução em seus próprios laboratórios.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer a Jeremy Garcia por testar este protocolo e Bhushan Kharbikar por fornecer treinamento sobre os equipamentos no Núcleo de Micro e Nanotecnologia Biomédica da UCSF. Esta pesquisa foi apoiada em parte por doações do Programa de Pesquisa do Câncer de Mama do Departamento de Defesa (W81XWH-10-1-1023 e W81XWH-13-1-0221), NIH (U01CA199315, DP2 HD080351-01, 1R01CA190843-01, 1R21EB019181-01A, e 1R21CA182375-01A1), nsf (MCB1330864) e o Centro de Construção Celular da UCSF (DBI-1548297), um Centro de Ciência e Tecnologia da NSF. O.J.S foi financiado por uma Bolsa de Pesquisa de Pós-Graduação da NSF, uma bolsa de estudos da Siebel, e uma bolsa de estudos para P.E.O. Z.J.G e A.R.A. são investigadores do Chan-Zuckerberg BioHub.
2-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | Thermo Fisher Scientific | 155379 | |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Adapter with External SM1 Threads and Internal SM3 Thread | ThorLabs | SM3A1 | |
Aldehyde Functionalized Slides | Schott | Nexterion Slide AL | Store under dry conditions after opening. |
All Plastic Syringes, 1 mL | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
Amine-Modified DNA Oligo | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
Aspheric Condenser Lens | ThorLabs | ACL7560 | |
Borosilicate Disc, 6in Diameter X 1/2in Thick | Chemglass | CG-1906-23 | |
Cell Culture Dishes 60×15 mm style | Corning | 353002 | |
Cholesterol-Modified Oligo | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
Diamond Scribe | Excelta | 475B | |
DNA Oligonucleotide | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | |
Isopropyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | |
Methylene Chloride (Stabilized/Certified ACS) | Fisher Scientific | D37-4 | |
MF-321 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | |
Microposit S1813 Positive Photoresist | Kayaku Advanced Materials | n/a | |
Ø3" Adjustable Lens Tube, 0.81" Travel | ThorLabs | SM3V10 | |
Oven | Thermo Scientific | 51-028-112H | |
PE-50 Compact Benchtop Plasma Cleaning System | Plasma Etch | PE-50 | |
Photomask (custom) | CAD/Art Services | n/a | Minimum feature size guaranteed by CAD/Art Services is 10 microns. |
Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
RCT Basic Hot Plate | IKA | 3810001 | |
Silicon Wafer (100 mm) | University Wafer | 590 | |
Sodium Borohydride, 98%, granules | Acros Organics | 419471000 | |
Spin Coater Kit | Instras | SCK-200 | This is a low cost option, but any spin coater that can maintain a speed of 3000 rpm will suffice. |
SU-8 2075 | Microchem | Y111074 0500L1GL | |
SU-8 Developer | Microchem | Y020100 4000L1PE | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 2646340 | |
Syringe Needles | Sigma-Aldrich | Z192341 | |
T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current | ThorLabs | LEDD1B | |
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl dimethylchlorosilane | Gelest | SIT8170.0 | |
Triethylamine | Sigma-Aldrich | 90335 | |
Turbo DNase | Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
Tweezers Style N7 | VWR | 100488-324 | The curved shape of these tweezers is essential for delicately picking up the PDMS flow cells containing patterned tissues. |
UV LED (365 nm, 190 mW (Min) Mounted LED, 700 mA) | ThorLabs | M365L2 | |
Wafer Tweezers | Agar Scientific | T5063 | |
WHEATON Dry-Seal vacuum desiccator | Millipore Sigma | W365885 |