Early Detection of Cyanobacterial Blooms and Associated Cyanotoxins using Fast Detection Strategy

Roberta Teta; Germana Esposito; Carlo De Sterlich; Massimiliano Lega; Valeria Costantino

doi:10.3791/61889

JoVE Journal > Chemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Chemistry

Hızlı Algılama Stratejisi Kullanılarak Siyanobakteri Çiçeklenmelerinin ve İlişkili Siyanotoksinlerin Erken Tespiti

Published: February 25, 2021

doi:

10.3791/61889

Roberta Teta¹, Germana Esposito¹, Carlo De Sterlich², Massimiliano Lega*³, Valeria Costantino*¹

¹TheBlueChemistryLab, Department of Pharmacy,University of Naples Federico II, ²Department of Public Health,University of Naples Federico II, ³Department of Engineering,University Parthenope

Summary

Siyanobakteri çiçeklenmelerinin ve ilişkili siyanotoksinlerin erken tespiti için hızlı multidisiplinerstrateji burada açıklanmıştır. Su örneklerinde ve bivalve numuneler gibi organik matrislerde siyanobakterilerin ve ilgili siyanotoksinlerin 24 saat içinde tespit edilmesine izin verir.

Abstract

Siyanobakterilerin ve siyanotoksinlerin hızlı tespiti Hızlı Algılama Stratejisi (FDS) kullanılarak sağlanır. Su örneklerinde ve bivalve özleri gibi organik bir matriste siyanobakterilerin ve ilgili siyanotoksinlerin varlığını çözmek için sadece 24 saat gereklidir. FDS, uzaktan/proksimal algılama tekniklerini analitik/biyoinformatik analizlerle birleştirir. Örnekleme noktaları, uzaktan algılama da dahil olmak üzere üç boyutlu bir fiziksel alanda çok disiplinli, çok ölçekli ve çok parametrik izleme yoluyla seçilir. Örneklerin mikroskobik gözlemi ve taksonomik analizi, siyanobakteri türlerinin tanımlanmasını sağlayan laboratuvar ortamında gerçekleştirilir. Numuneler daha sonra organik çözücülerle çıkarılır ve LC-MS/MS ile işlenir. Bu ağlar, kütle spektrometresi tarafından elde edilen parçalanma spektrumunun verilerini GNPS kütüphanesi ile karşılaştırarak toksinleri tespit etmek ve tanımlamak için analiz edilir. Bu, aynı moleküler ağda ilişkili görünen bilinen toksinlerin ve bilinmeyen analogların tespit edilmesine izin verir.

Introduction

Siyanobakteri çiçekleri son 15 yılda tüm dünyada bir çevre sorunu olarak ortaya çıkmıştır¹^,². Siyanobakteriler çiçeklenmeler, siyanobakteriler adlı mikroorganizmaların aşırı büyümesinden kaynaklanmaktadır. Tropikal alanlar ve aşırı soğuk sular da dahil olmak üzere çok çeşitli ortamlarda yaşamak için kendilerini adapte etmiş fotosentetik mikroorganizmaların göze çarpan bir grubudur. Özellikle ötrofikasyon işlemi³olarak adlandırılan büyük bir besin zenginleştirmesine yanıt olarak su yüzeylerini kaplayan büyük çiçekler üretmeleri ile bilinirler.

Bu nedenle, siyanobakteriler su kirliliğinin mükemmel biyoindikatörleridir⁴^,⁵^,⁶. Ayrıca ilginç farmakolojik özelliklere sahip çok çeşitli doğal bileşikler üretebilirler⁷^,⁸. Siyanobakterilerle ilgili çevre sorunu çiçeklenmelerin kendileridir. Çiçekler güneş ışığını sualtı otlarına engelleyebilir, balık öldürmelerine yol açan suda oksijen tüketebilir, yüzey pisliği ve koku üretebilir ve organizmaların filtre beslemesine müdahale edebilir⁹.

Ek olarak ve daha da önemlisi, sıcaklık, besin maddeleri (fosfor ve azot), güneş ışığı (fotosentez için) ve suyun pH’ı gibi faktörlerin belirli bir kombinasyonunda siyanobakteri çiçekleri toksin üretimini tetikler; bu nedenle, insanlar ve hayvanlar için zararlı hale gelir. En çok çalışılan siyanotoksin sınıfı Mikrosikt cins tarafından üretilir. Bunlar mikrosistinlerin (MC) genel adı altında bilinen döngüsel peptitlerdir: mikrosistin-LR, şiddetli hepatoksisite üretebilmek için en çok çalışılan¹⁰. Hayvanlar ve insanlar, kontamine içme suyu veya yiyeceklerin yutulmasıyla MCS’lere maruz kalabilir. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) kılavuz¹¹olarak toplam mikrosistin-LR değerinin 0.001 mg/L olduğunu öne sürdü. Bununla birlikte, bu, şimdiye kadar izole edilmiş 100’den fazla mikrositten sadece bir varyantla (yani MC-LR) ilgilidir.

Maldi-TOF MS analizi^{12 , 13 , 14}^,¹⁵ile uzaktan algılama gibi daha önce bildirilen birleşik yöntemler, MCS’lerin konsantrasyon tespitine odaklanmıştır. En son yöntemler, yalnızca geniş çiçeklenme genişliklerini tespit etmede etkili olan düşük çözünürlüklü sensörler kullanır; ayrıca sadece standartların mevcut olduğu toksinleri ortaya çıkarabilirler. Ayrıca, bu prosedürlerin çoğu zaman alıcıdır ve zaman, güvenlik sorunlarını önlemek veya en aza indirmek için çiçeklenmenin erken tespiti için dramatik bir faktördür. Burada önerilen multidisipliner strateji, siyanobakteriler çiçeklenme ve siyanotoksinlerin sadece 24 saat^16’dansonra hızlı bir şekilde tespitini sağlar.

MuM3 adlı program çerçevesinde, “Üç boyutlu (3D) fiziksel alanda çok disiplinli, çok ölçekli ve çok parametrik izleme”¹⁷^,¹⁸, hızlı algılama stratejisi (FDS) çeşitli tekniklerin avantajlarını birleştirir: 1) çiçeği tespit etmek için uzaktan algılama; 2) siyanobakteri türlerini tespit etmek için mikroskobik gözlem; ve 3) cyanotoksinleri tespit etmek için analitik/biyoinformatik analizleri, yani LC-HRMS tabanlı moleküler ağ. Sonuçlar 24 saat içinde elde edilir.

Yeni yaklaşım, geniş kıyı alanlarını kısa sürede izlemek, çok sayıda örnekleme ve analizden kaçınmak ve tespit süresini ve maliyetlerini azaltmak için yararlıdır. Bu strateji, siyanobakterilerin ve toksinlerinin izlenmesine yönelik farklı yaklaşımların incelenmesi ve uygulanmasının sonucudur ve her birinin avantajlarını birleştirir. Özellikle, siyanobakteri türlerinin (mikroskop, UV-Vis spektroskopisi, 16S analizi) ve toksinlerin (LC-MS analizi, moleküler ağ) tanımlanması için çeşitli metodolojik yaklaşımlar gibi uzaktan algılama analizi için farklı platformların (uydu, uçak, drone) ve sensörlerin (MODIS, termal kızılötesi) kullanımından kaynaklanan sonuçların analizi, hem spesifik hem de genel amaçlar için en uygun yöntemin seçilmesine izin verdi. Yeni metodoloji, Campania çevre koruma ajansı izleme programı çerçevesinde Campania kıyılarında (İtalya) sonraki izleme kampanyalarında denendi ve doğrulandı.

Şekil 1: FDS stratejisi. Siyanobakteriler ve siyanotoksinler için Hızlı Algılama Stratejisi’ne genel bakış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protocol

1. Uzaktan ve proksimal algılama: veri toplama ve analiz NOT: Bu durumda, uzak/proksimal algılama verileri ilk makro alan araştırması için ve örneklenecek kıyı alanlarının belirli noktalarını seçmek için kullanılır. MuM3 framework17 düzeninde mantık akışı, bilgi katmanları adlı çeşitli düzeyleri içeren hiyerarşik bir izleme modelini temel almıştır. Her seviyenin bilgileri, farklı irtifalarda bulunan yerleşik platformlarda taşınan bir veya daha fazla sensör kullanılarak elde edilen verilere dayanmaktadır. Her seviye, ölçümün yüksekliğine bağlı olarak19uzaysal bir ölçek tanımlar. Her seviyede birden fazla sensör potansiyeli vardır. Bazı örnekler şunlardır: uydularda, uçaklarda, helikopterlerde, İhA21’de ve yüzeyde kızılötesi (VNIR) ve termal kızılötesi (TIR) görüntüleme20 yakınında görülebilir; fiziksel, kimyasal ve biyolojik analizler,vb. Her sensör tarafından elde edilen veriler, multispektral indeksleri (örneğin, normalleştirilmiş fark bitki örtüsü indeksi (NDVI), Normalleştirilmiş Fark Su İndeksi (NDWI), Klorofil İndeksi vb.) hesaplamak için işlenir ve birleştirilir, böylece ham veriler daha kullanışlı parametrelere ve formatlara (örneğin, tematik harita) dönüştürülür. Şekil 2: Örnekleme için uzaktan/proksimal algılama analizleri (adım 1-2). Siyanobakteri çiçeklenmenin tespiti için çok seviyeli ve çok sensörlü yaklaşım. Veri toplama uydu (A), uçak (B) ve / veya drone (C) tarafından gerçekleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Uzaktan ve proksimal algılama veri alma Özellikle içerik tabanlı alma ve sahne sınıflandırması için üretilen çeşitli genel ve özel uzaktan algılama veri kümelerinden veri alın. Bu adımda kullanılan tipik veri kümesi kaynakları şunlardır: ABD Jeoloji Araştırmaları23, NASA24tarafından sağlanan Sentinel-2,3 ürünleri ve Copernicus Open Access Hub25, MODIS-Aqua26tarafından sağlanan Landsat ürünleri. Belirli bir alan, tarih aralığı için mevcut ürünleri tanımlayın ve bulut örtüsü tarafından türetilen sınırı göz önünde bulundurun. Tanımla: A) grafik kullanıcı arayüzü ve çokgen seçimi kullanarak ilgi alanı; B) metin sorgusu filtre alanlarını kullanarak tarih aralığı ve bulut kapsamı.NOT: Birçok bilimsel rapor kabul edilebilir bir bulut örtüsü değerinin % 20 < olduğunu belirtse bile, bu tür araştırmalarda, gerçek bulut örtüsüne sadece su yüzeyinde dikkat etmek önemlidir, bu nedenle bu bölge için bir etkinlik değeri% <5'tir. Misyonun özel ihtiyaçlarına en uygun platformlardan elde edilen ürünleri seçin. Uydu ve yük teknik özelliklerinin her kombinasyonundan, çeşitli ürün koleksiyonları elde etmek mümkündür. Örneğin, NASA EOSDIS24 veri ürünleri Seviye 0’dan Seviye 4’e kadar çeşitli düzeylerde işlenir: Seviye 0 ürünleri tam enstrüman çözünürlüğünde ham verilerdir, daha yüksek seviyelerde ise veriler daha kullanışlı parametrelere ve formatlara dönüştürülür. Genellikle, Seviye 0-1 mevcuttur, Seviye 2-4’teki ürünlerin belirli araştırma hedefleriyle ilgili belirli işleme ihtiyacı vardır, bu nedenle kullanılabilirlikleri zamanla sınırlıdır ve bölge kapsanır. Uydu gözlemlerinin seçilen veri kümesini indirin. Ayrıntılı olarak, önceki eylemden elde edilen sonuçların listesi arasından seçim yaparak, tam bir veri kümesi ürünü (örneğin, bir grup coğrafi fark dosyası, her bant için bir tane, artı bilgiler ve diğer meta veriler) veya yalnızca belirli bir tek bant indirin.NOT: 1. adım prosedüründe yer alan her temel eylemin özel açıklaması için lütfen Huan-HuanChen ve ark. Makro alanının ilk gösterimine izin vermek için analiz ve daha yararlı parametrelere ve biçimlere dönüştürme için veri ön işleme ve işleme.NOT: Aşağıdaki eylemler (adım 1.2), alt düzeylerden gelen ham verileri bilgiye ve daha sonra yararlı bilgilere (daha yüksek düzeyler) dönüştürmek için sonlandırılmış veri işlemeye adanmıştır. Bu adım, her sensörden gelen ham verilerin işlenmesinden (örneğin, ürün Seviyeleri 0-1) ve daha yüksek seviyeli ürünlere (örneğin, Seviyeler 2-4) ve daha sonra daha kullanışlı parametreler ve formatlar (örneğin tematik harita) oluşturmak için bilgi katmanlarına dönüştürülmesinden oluşur. Geometrik ve radyometrik kalibrasyonu içeren ön proses ham verileri. Bu eylem, doğru bir iş akışına saygı gösteren kolay bir sınıflandırma gerçekleştirmek için raster işleme için bir dizi bağlı araç sağlayan (denetimsiz veya denetimli) belirli bir yazılım kullanılarak gerçekleştirilebilir.NOT: Bu araştırmada iki ücretsiz açık kaynak aracı kullanılmaktadır: Q-GIS 3.1428, Yarı Otomatik Sınıflandırma Eklentisi (SCP) ile birlikte. SCPeklentisi 29, uzaktan algılama görüntülerinin yarı otomatik sınıflandırılmasına izin vererek ücretsiz görüntülerin indirilmesi, ön işleme, işlem sonrası ve raster hesaplama için eksiksiz bir araç seti sağlar. Multispektral indeksleri hesaplayan kalibre edilmiş verileri işleyin. Genellikle, bu eylem bir raster hesap makinesi aracı kullanılarak gerçekleştirilir. Multispektral dizinin hesaplanması, sonuç olarak bir CBS platformunda yönetilebilen yeni bir katman oluşturan farklı bantlar/katmanlar arasında bir korelasyon tanımlar. Örneğin, Sentinel ve Landsat operasyonel arazi görüntüleyicisi sensöründen (OLI) başlayarak, Normalleştirilmiş Fark Bitki Örtüsü İndeksi (NDVI) gibi multispektral indeksleri hesaplamak mümkündür. Bitki örtüsü indeksi daha sonra klorofil içeriğini tahmin etmek için kullanılır30,31. Yanlış renk tematik haritalarda olduğu gibi temsil edilen klorofil içerik indeksinin tahmininden elde edilen sonuçları analiz edin ve yüksek klorofil konsantrasyonuna sahip kritik alanı tanımlayın. Bu çalışmada, Terra ve Aqua uydu platformlarına monte edilmiş MODIS sensörü32veri kümesi kullanılarak klorofil-a haritası oluşturulmuştır. Örnekleme noktaları anormal değerlerin kaydedildiği yerlerde lokalize edilir.NOT: Chl-a konsantrasyonu 20 mg/L33’üaştığında uzak algılama alanında alg çiçek açma bayrağı (her bir noktayı tanımlayan) yükseltilir. 2. Kılavuzlu örneklemeler NOT: Örnekleme noktalarının seçimi, geniş kıyı bölgelerindeki noktaların seçilmesini sağlayan uzaktan / proksimal algılama katmanı analizi ile yönlendirilir. Mikrosiktinlerin toksisitesi nedeniyle numune almanın operatörler için tehlikeli olabileceği göz önünde bulundurularak, güvenlik örnekleme prosedürlerine ihtiyaç vardır. Özellikle, operatörleri aerosol soluma ve cilt temasından korumak için gereklidir. Ardından, aşağıda ayrıntılı olarak açıklanan prosedürü izleyerek örnekleme yapın. Göz koruması için gözlük, aerosol soluma önlemek için FFP2 maskesi ve cilt temasını önlemek için güvenlik eldivenleri takın. Her sitede üç taraflı olarak 0,5 L su toplayın. Bir refraktometre kullanarak her numunenin tuzluluğunu ölçün. Numunenin bir damlasını refraktometreye koyun ve binde bir parça (ppt – ‰) açısından tuzluluk değerini okuyun. Örneklemenin sonunda, önce elleri yıkayın; ardından eldivenleri, maskeyi ve gözlükleri kişisel koruma ekipmanının dış yüzeyine dokunmamaya dikkat ederek çıkarın. Numuneyi oda sıcaklığında laboratuvara taşıyın. 3. Siyanobakteri türlerinin mikroskobik gözlemler ve taksonomik tanımlama ile tanımlanması Her numuneyi (≈0,5 L) 11.200 x g’da 5 dakika santrifüj edin. Süpernatantları aşağıdaki gibi ayıklayın: her numuneye 500 mL butanol dökün ve bir huni kullanarak, çıkarılacak karışımı ayırıcı hunine aktarın. Her iki katmanın da ayrılmasını sağlamak için ayırıcı huniyi halka kelepçesine dik olarak yerleştirin. Sulu fazın bir Erlenmeyer şişesinde boşalmasına izin verin. Bu adımı üç kez tekrarlayın. Daha sonra organik fazları vakum altında konsantre edin ve tartın. 3.1. adımdan pelet toplayın ve mikroskop için 18 MP dijital kamera ile donatılmış optik mikroskopla 400x ve 1.000x büyütmede analiz edin. Morfolojik özelliklerine dayanarak siyanobakterilerin varlığını arayın: mavi-yeşil renk, hücre şekli ve boyutu, siyanobakterilerin diğer mikroorganizmalar arasında tanınmasını sağlar. Komarék ve ark. 201434’teaçıklanan prosedüre göre, mikroskobik gözlemle taksonomik analiz yoluyla türleri tanımlayın.NOT: Siyanobakteriyal takson3’üntanımlanması için tamamlayıcı 16S metanezomik analiz yapılabilir. Peletlerin bir aliquotunu, tuzluluğuna göre, ekim için 10 mL deniz suyu / tatlı su BG11 ortamı ile seyreltin. 4. Siyanotoksinlerin tanımlanması Organik çözücüler ile numunelerin çıkarılması Her bir pelet örneğini bir şişeye koyun ve bir buz banyosu kullanarak 5 dakika boyunca sonicate. Ardından, 50 mL taze MeOH ekleyin ve hafifçe çalkalayın. Çözeltiyi bir kağıt filtre kullanarak filtreleyin ve filtratları yuvarlak bir alt şişede toplayın. Bu adımı iki kez yineleyin. Ardından, iki kez (1:1, 50 mL) ve iki kez% 100 DCM (x2, 50 mL)35kullanarak 50 mL MeOH / DCM karışımı ekleyerek peletleri çıkarın. Her yuvarlak alt şişeyi sırasıyla “MeOH özü”, “MeOH/DCM özü” ve “DCM özü” olarak etiketlenin ve vakum altında yoğunlanın. Her organik özü (MeOH, MeOH/DCM, DCM) LC-HRMS/MS ile analiz edin. LC-HRMS/MS analizi LC-HRMS ve LC-HRMS/MS numunelerinin hazırlanması: 10 mg/mL’lik son konsantrasyonu elde etmek için her numuneyi ,9’≥ MeOH kullanarak çözün. Her numuneyi bir HPLC sistemi (LC-HRMS/MS sistemi) ile birlikte yüksek çözünürlüklü bir ESI kütle spektrometresi kullanarak analiz edin. HpLC üzerinde oda sıcaklığında 5-μm C18 sütun (100 x 2,10 mm) ile çalışın. H 2 O(%0,1HCOOH ile desteklenmiştir) ve MeOHat 200 μL dk-1ile degrade bir elüasyon kullanın. Degrade programı: 3 dakika için% 10 MeOH, 30 dakika için% 10 ila% 100 MeOH, 7 dakika için% 100 MeOH. Kontrol olarak MeOH kullanın. Veri toplama. Veriye bağımlı toplama modunda (DDA) veri toplayın: Tam tarama kütle spektrumunun en yoğun 10 iyonunun yüksek çözünürlüklü tandem kütle spektrometresi (HRMS/MS) analizine tabi tutulması gerekir. CID parçalanması, yalıtım genişliği 2.0, normalleştirilmiş çarpışma enerjisi 35, Aktivasyon Q’su 0.250 ve etkinleştirme süresi 30 ms olan seçili iyonlar için HRMS/MS taramaları alın. Biyoinformatik analizler ve moleküler ağ MS’e özgü yazılımı kullanarak her yoğun iyon için parçalanma desenlerini çözümleme. Verileri kümelemek için MS Kümesi’ni kullanın (1,0 Da’nın üst kütle toleransı ve 0,5 Da’nın MS/MS parça iyon toleransı). 2’den az spektrum içeren konsensüs spektrumları ortadan kaldırılmıştır. Moleküler ağ için GNPS (Global Natural Products Social36)tarafından MS/MS verilerini analiz edin. Eş zamanlı olarak konsensüs spektrumlarını ve ayrıca GNPS-Mass-Ive kütüphanelerinde bildirilenlerle karşılaştırın. Elde edilen ağı görselleştirin37.NOT: Moleküler ağ için lütfen Sigrist ve ark. 202038adresine bakın. Şekil 3: FDS laboratuvar içi adımlar (3-4). Örnekleme sonrası laboratuvarda gerçekleştirilen ana faaliyetlerin görsel temsili (adım 3 ve 4). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Representative Results

İlk çalışmada3, SW İtalya’daki Campania sahili boyunca antropojen olarak etkilenen dört saha, 2015 yazında Landsat 8 uydusu ve uçakları kullanılarak gözlemlendi. Landsat 8 operasyonel kara görüntüleyici sensörü (OLI) ve uçak multispektral kamerası, siyanobakteri topluluklarının varlığını ortaya çıkarmak için alanlar için Normalleştirilmiş Fark Su İndeksi (NDWI) görüntüleri oluşturmaya izin verdi. Siyanobakteriyal pigment fitokyanin (PC) tespiti için spektrofotometrik analizlerle siyanobakteriyal topluluk kompozisyonu belirlendi. Daha sonra tamamlayıcı 16S metaagenomik analiz siyanobakteriyal takson tanımlamaya izin verildi. Metamanyamik analizlerle birlikte uydu/hava platformları aracılığıyla basitleştirilmiş multispektral görüntü indeksleme ve sınıflandırma, çiçeklenmenin erken bir aşamasında güçlü ötrofik koşullarla ilişkili cinslere (Leptolyngbya sp., Pseudooscillatoria sp. gibi) ait siyanobakterilerin varlığını tespit etmede etkili oldu. İkinci bir çalışmada14, FDS yaklaşımı İlkbahar/Yaz 2017 döneminde test edildi. Uydu verileri tek uzaktan algılama seviyesi olarak kullanıldı. Ayrıntılı olarak, Terra ve Aqua uydu platformlarına monte edilen MODerate Image Spectroradiometer (MODIS) sensörü tarafından elde edilen veriler, Campania kıyılarındaki su kütlelerinde klorofil-a’nın (Chl-a) ölçülmesini sağladı ve on örnekleme noktası seçimini yönlendirdi. Numuneler laboratuvarda mikroskobik gözlem ve taksonomik tanımlama ile işlendi, daha sonra organik çözücülerle çıkarıldı. Organik özler LC-MS-MS analizi ile işlendi. MS-MS tarafından elde edilen veriler, molekül ağı oluşturmak için GNPS platformu kullanılarak biyoinformatik bir yaklaşım kullanılarak analiz edildi. Ağ, kütle spektrometresi ile elde edilen parçalanma spektrumunun verilerini GNPS kütüphanesi ile karşılaştıran toksinleri tespit etmek ve tanımlamak için analiz edildi. Bu, aynı moleküler ağda ilişkili görünecek bilinen toksinleri ve bilinmeyen analogları tespit etmeyi sağladı. Özellikle, lipofilik dermatotoksinler olan Lyngbyatoxin A, tüm su örneklerinde ve bivalves örneklerinde tespit edildi; Lyngbyatoxin A moleküler kümesinde, lyngbyatoxin ailesinin bilinen herhangi bir bileşiğiyle ilgili olmayan düğümler de mevcuttu, bu da bilinmeyen lyngbyatoxin analoglarının varlığını düşündürmektedir. Örneklerde mikrosiktin ve diğer toksinler saptanmedi. Tüm sonuçlar 24 saat içinde elde edildi. Şekil 4: FDS temsili sonuçları. Campania sahilinde (İtalya) FDS stratejisinin uygulanmasına bir örnek. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Geçtiğimiz yıllarda ekibimiz, su kütlelerinde ve bivalveslerde siyanobakteriler ve siyanotoksinlerin varlığının çözülmesine izin veren birkaç farklı yaklaşımı test etti ve doğruladı. Geliştirilen yeni strateji bu çalışmaların sonucunu temsil ediyor. Hızlı algılama kapsamına uygun en uygun teknikler ve teknolojiler, her bir adımın etkinliğini en üst düzeye çıkaran benzersiz bir prosedür şapkası altında toplanır. Hedef alan, çiçeklenme uzantısı ve büyüme aşaması, kullanılacak uygun yöntem ve teknolojilerin seçimine itici güçtür.

Siyanobakteriler ve siyanotoksinler hızlı algılama öncelik olduğunda, strateji toplam sayıyı dört ana adıma indirerek düzenlenir: (1) İlk anket için Uzaktan ve Proksimal algılama ve veri analizi, sitelerin lokalizasyonu ve çiçeklenme deseni ve uzantısının tanımı; (2) Kılavuzlu örnekleme; (3) Mikroskobik gözlem ve taksonomik analiz; (4) Su numunelerinin dereplication ve siyanotoksinlerin hızlı tespiti için LC-MS verilerinin kimyasal analizi ve moleküler ağı.

İlk adımla ilgili olarak, hiyerarşik izleme yaklaşımının tüm katmanlarını kapsayan eksiksiz bir platform zinciri tarafından elde edilen verilerin kullanılabilirliği, analiz edilen senaryonun tam bir vizyonunu yeniden ortaya çıkarmak için en iyi çözüm olsa bile, genellikle yalnızca bir bilgi katmanı alan araştırması eylemini yönlendirebilir ve yerinde örnekleme eylemleri gerçekleştirmek için sıcak noktalara etkili bir şekilde odaklanabilir. Verilerin uydular, uçaklar, helikopterler, İhA’lar kullanılarak elde edildiği bildirilen deneyimlere göre, hızlı tespit stratejisinin gerektirdiği ihtiyaçlara tamamen uyan çözüm, tek uydu ürünlerinin kullanılmasıdır.

Buna ek olarak, uydulardan (örneğin uçaklar, helikopterler, İhA’lar) daha düşük irtifalarda uçan platformlar tarafından gerçekleştirilen görevlerden türeyen bilgi katmanları, bilgileri büyük bir çözünürlükle yatıştırır, ancak bunlar çok pahalıdır ve ayrıca uçuş planı tanımlama ve onayını da içeren tam satın alma sürecini tamamlamak için daha fazla zaman gerektirir.

Örnek olacak noktalar seçildikten sonra (adım 2), analitik/biyoinformatik analizler (LC-MS verilerinin moleküler ağı), su örneklerinin hızlı bir şekilde dereplication ve siyanotoksinlerin hızlı tespiti için bir araçtır (adım 3 ve 4). 16S metamanyamik analiz en az 2 hafta çalışma gerektirir. Ayrıca, genel olarak toksik olan siyanobakteri türleri tanımlansa bile, toksin üretimi gösterilmez. Aynı nedenle, mikroskobik gözlem toksik siyanobakterilerin varlığını ortaya çıkarmak için yeterli değildir. Tabii ki, MS analizi ve moleküler ağın bazı sınırlamaları vardır; faiz bileşikleri (örneğin, toksinler) uygulanan koşullarda iyi iyonize edilirse, tespit edilecek yeterli miktarda ise oldukça etkilidir. Bilinen siyanobakteriyel toksin tespiti ve izlenmesi amacıyla, MS tabanlı moleküler ağ aslında daha sağlam ve güvenilir teknolojilerden birini temsil eder.

Bu nedenle, siyanobakterilerin ve ilgili siyanotoksinlerin hızlı bir şekilde tespit edilmesi gerektiğinde bu yaklaşımın oldukça yararlı olduğu kanıtlanır; ayrıca, hem siyanobakteri çiçeklenmenin hem de toksinin uzay ve zaman içinde ölçülmesi, sağlık topluluklarının büyük siyanobakteriyel toksik çiçeklenmelerin ortaya çıkarabileceği sorunları önlemek için bu strateji ile de mümkündür.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu araştırma “Attività pilota di Monitoraggio di Cianobatteri nella fascia costiera della regione Campania” projesi çerçevesinde “Centro di Riferimento Regionale per la Sicurezza Sanitaria del Pescato (CRiSSaP)” tarafından finanse edildi. ve Campania Bölgesi Çevre Koruma Ajansı, İtalya (ARPAC), “Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno/Osservatorio Regionale per la Sicurezza Alimentare” (IZSM/ORSA), Napoli Üniversitesi “Federico II” – Veterinerlik ve Hayvansal Üretim Bölümü, ref.

Materials

10X Vitamin mix			Nicotinic acid 100 mg/100 mL; PABA 10 mg/100 mL; Biotin 1 mg/100 mL; Thiamine 200 mg/100 mL; B₁₂ 1 mg/100 mL; Folic Acid 1 mg/100 mL; i-inositol 1 mg/100 mL; Ca-pantothenate 100 mg/100 mL
1-BuOH	Sigma-Aldrich	33065.2.5L-R
BG11 stock solution			Na₂EDTA 20 mg/L; Ferric ammonium citrate 120 mg/L; Citric acid·1H₂O 120 mg/L; CaCl₂·2H₂O 700 mg/L, MgSO₄·7H₂O 1.5 g/L, K₂HPO₄·3H₂O 800 mg/L, NiSO₄(NH₄)2SO₄·6H₂O (0.1 mM stock) 5 mL; Na₂SeO₄ (0.1 mM stock) 2 mL, Nitsch's Solution 20 mL
Centrifuge	Hermle	Z36HK
CHCl₃	Honeywell	32211.2.5L
H₂O	Sigma-Aldrich	34877.2.5L
Kinetex C18 cloumn	Phenomenex
LTQ Orbitrap XL high-resolution ESI mass spectrometer coupled to a U3000 HPLC system	Thermo
MeOH	Honeywell	32213.2.5L
Microscope equipped with an OMAX 18 MP CMOS camera	Optech	Biostar B3
Multiband camera	Intergraph DMC
Nitsch's Solution			H₃BO₃0.5 g/L MnSO₄· H₂O 2.28 g/L ZnSO₄·7H₂O 0.5 g/L CuSO₄·5H₂O 0.025 g/L COCl₂·6H₂O 0.135 g/L Na₂MoO₄·2H₂O 0.025 g/L
Refractomer mr 100 ATC	AQL
SWBG11 medium			BG11 stock solution 50 mL/L; Instant Ocean 33 g/L; Water 950 mL/L 10X; Vitamin mix 100 µL/L

References

Tamele, I. J., Silva, M., Vasconcelos, V. The incidence of marine toxins and the associated seafood poisoning episodes in the African countries of the Indian ocean and the Red sea. Toxins. 11 (1), 25-48 (2019).
Lürling, M., Faassen, E. J. Dog poisonings associated with a Microcystis aeruginosa bloom in the Netherlands. Toxins. 5 (3), 556-567 (2013).
O’Neil, J. M., Davis, T. W., Burford, M. A., Gobler, C. J. The rise of harmful cyanobacteria blooms: The potential roles of eutrophication and climate change. Harmful Algae. 14, 313-334 (2012).
Teta, R., et al. Cyanobacteria as indicators of water quality in Campania coasts, Italy: A monitoring strategy combining remote/proximal sensing and in situ data. Environmental Research Letters. 12 (2), (2017).
Teta, R. Bioindicators as a tool in environmental impact assessment: Cyanobacteria as a sentinel of pollution. International Journal of Sustainable Development and Planning. 14 (1), 1-8 (2019).
Teta, R., Della Sala, G., Mangoni, A., Lega, M., Costantino, V. Tracing cyanobacterial blooms to assess the impact of wastewaters discharges on coastal areas and lakes. International Journal of Sustainable Development and Planning. 11 (5), 804-811 (2016).
Teta, R., et al. A joint molecular networking study of a: Smenospongia sponge and a cyanobacterial bloom revealed new antiproliferative chlorinated polyketides. Organic Chemistry Frontiers. 6 (11), 1762-1774 (2019).
Singh, R. K., Tiwari, S. P., Rai, A. K., Mohapatra, T. M. Cyanobacteria: an emerging source for drug discovery. Journal of Antibiotics. 64 (6), 401-412 (2011).
Huisman, J., et al. Cyanobacterial blooms. Nature Reviews Microbiology. 16 (8), 471-483 (2018).
Gupta, N., Pant, S. C., Vijayaraghavan, R., Rao, P. V. L. Comparative toxicity evaluation of cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin variants (LR, RR, YR) in mice. Toxicology. 188 (2-3), 285-296 (2003).
WHO. Cyanobacterial toxins: Microcystin-LR in drinking water. Background document for development of WHO Guidelines for Drinking-Water Quality. WHO. 2, (1998).
Agha, R., Cirés, S., Wörmer, L., Domínguez, J. A., Quesada, A. Multi-scale strategies for the monitoring of freshwater cyanobacteria: Reducing the sources of uncertainty. Water Research. 46 (9), 3043-3053 (2012).
Giménez-Campillo, C. Determination of cyanotoxins and phycotoxins in seawater and algae-based food supplements using ionic liquids and liquid chromatography with time-of-flight mass spectrometry. Toxins. 11 (10), 610 (2019).
Sanseverino, I., António, D. C., Loos, R., Lettieri, T. Cyanotoxins: methods and approaches for their analysis and detection. JRC Technical Reports. , (2017).
Teta, R. Combined LC-MS/MS and molecular networking approach reveals new cyanotoxins from the 2014 cyanobacterial bloom in Green Lake, Seattle. Environmental Science and Technology. 49 (24), 14301-14310 (2015).
Esposito, G., et al. A fast detection strategy for cyanobacterial blooms and associated cyanotoxins (FDSCC) reveals the occurrence of lyngbyatoxin A in campania (South Italy). Chemosphere. 225, 342-351 (2019).
Lega, M., Casazza, M., Teta, R., Zappa, C. J. Environmental impact assessment: a multilevel, multi-parametric framework for coastal waters. International Journal of Sustainable Development and Planning. 13 (8), 1041-1049 (2018).
Di Fiore, V. Integrated hierarchical geo-environmental survey strategy applied to the detection and investigation of an illegal landfill: A case study in the Campania Region (Southern Italy). Forensic Science International. 279, 96-105 (2017).
Gargiulo, F., Persechino, G., Lega, M., Errico, A. IDES project: A new effective tool for safety and security in the environment. Lecture Notes in Computer Science (including subseries Lecture Notes in Artificial Intelligence and Lecture Notes in Bioinformatics). , (2013).
Ferrara, C., Lega, M., Fusco, G., Bishop, P., Endreny, T. Characterization of terrestrial discharges into coastal waters with thermal imagery from a hierarchical monitoring program. Water. 9 (7), (2017).
Alfeo, A. L., Cimino, M. G. C. A., De Francesco, N., Lega, M., Vaglini, G. Design and simulation of the emergent behavior of small drones swarming for distributed target localization. Journal of Computational Science. 29, 19-33 (2018).
Casazza, M., Lega, M., Liu, G., Ulgiati, S., Endreny, T. A. Aerosol pollution, including eroded soils, intensifies cloud growth, precipitation, and soil erosion: a review. Journal of Cleaner Production. 189, 135-144 (2018).
. U.S. Geological Survey Available from: https://ers.cr.usgs.gov (2020)
. NASA Earthdata Available from: https://urs.earthdata.nasa.gov (2020)
. Copernicus Opern Access Hub Available from: https://scihub.copernicus.eu/apihub (2020)
Chen, H. -. H., Tang, R., Zhang, H. -. R., Yu, Y., Wang, Y. Investigating the relationship between sea surface chlorophyll and major features of the south china sea with satellite information. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), (2020).
. QGIS Available from: https://www.qgis.org/it/site/ (2020)
. Semi-automatic classification plugin documentation release 4.8.0.1 Available from: https://manualzz.com/doc/7130012/semi-automatic-classification-plugin-documentation (2016)
Rouse, J. W., Hass, R. H., Schell, J. A., Deering, D. W. Monitoring vegetation systems in the great plains with ERTS. Third Earth Resources Technology Satellite (ERTS) Symposium. 1, 309-317 (1973).
Carmona, F., Rivas, R., Fonnegra, D. C. Vegetation index to estimate chlorophyll content from multispectral remote sensing data. European Journal of Remote Sensing. 48 (1), 319-326 (2015).
Savtchenko, A., et al. MODIS data from terra and aqua satellites. International Geoscience and Remote Sensing Symposium (IGARSS). 5, 3028-3030 (2003).
Binding, C. E., Greenberg, T. A., McCullough, G., Watson, S. B., Page, E. An analysis of satellite-derived chlorophyll and algal bloom indices on Lake Winnipeg. Journal of Great Lakes Research. 44 (3), 436-446 (2018).
Komárek, J., Kaštovský, J., Mareš, J., Johansen, J. R. Taxonomic classification of cyanoprokaryotes (cyanobacterial genera) 2014, using a polyphasic approach. Preslia. 86, 295-335 (2014).
Esposito, G., et al. Chlorinated thiazole-containing polyketide-peptides from the caribbean sponge smenospongia conulosa: structure elucidation on microgram scale. European Journal of Organic Chemistry. 2016 (16), 2871-2875 (2016).
Shannon, P. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Research. 13 (11), 2498-2504 (2003).
Sigrist, R., Paulo, B. S., Angolini, C. F. F., De Oliveira, L. G. Mass spectrometry-guided genome mining as a tool to uncover novel natural products. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Teta, R., Esposito, G., De Sterlich, C., Lega, M., Costantino, V. Early Detection of Cyanobacterial Blooms and Associated Cyanotoxins using Fast Detection Strategy. J. Vis. Exp. (168), e61889, doi:10.3791/61889 (2021).

Automatically Generated