Early Detection of Cyanobacterial Blooms and Associated Cyanotoxins using Fast Detection Strategy

Roberta Teta; Germana Esposito; Carlo De Sterlich; Massimiliano Lega; Valeria Costantino

doi:10.3791/61889

JoVE Journal > Chemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Chemistry

גילוי מוקדם של פריחות ציאנובקטריאליות וציאנוקסינים נלווים באמצעות אסטרטגיית זיהוי מהירה

Published: February 25, 2021

doi:

10.3791/61889

Roberta Teta¹, Germana Esposito¹, Carlo De Sterlich², Massimiliano Lega*³, Valeria Costantino*¹

¹TheBlueChemistryLab, Department of Pharmacy,University of Naples Federico II, ²Department of Public Health,University of Naples Federico II, ³Department of Engineering,University Parthenope

Summary

כאן מתוארת בעיה רב-תחומית לגילוי מוקדם של פריחות ציאנובקטריאליות וציאנוטוקסינים נלווים. זה מאפשר זיהוי של ציאנובקטריה וציאנוקסינים הקשורים בדגימות מים ומטריצות אורגניות, כגון דגימות דו-כיווניות, תוך 24 שעות.

Abstract

זיהוי מהיר של ציאנובקטריה וציאנוקסינים מושגת באמצעות אסטרטגיית זיהוי מהירה (FDS). רק 24 שעות נדרשות כדי לפענח את נוכחותם של ציאנובקטריה וציאנוטוקסינים קשורים בדגימות מים ובמטריצה אורגנית, כגון תמציות דו-כיווניות. FDS משלב טכניקות חישה מרוחקות/פרוקסימליות עם ניתוחים אנליטיים/ביואינפורמטיים. נקודות דגימה נבחרות באמצעות ניטור רב-תחומי, רב-ממדי ורב-פרמטרי במרחב פיזי תלת מימדי, כולל חישה מרחוק. תצפית מיקרוסקופית וניתוח טקסונומי של הדגימות מבוצעים במסגרת המעבדה, המאפשרת זיהוי של מינים ציאנובקטריאליים. דגימות מופקות לאחר מכן עם ממיסים אורגניים ומעובדות עם LC-MS / MS. נתונים המתקבלים על ידי MS / MS מנותחים באמצעות גישה ביואינפורמטית באמצעות הפלטפורמה המקוונת גלובל מוצרים טבעיים חברתיים (GNPS) כדי ליצור רשת של מולקולות. רשתות אלה מנותחות כדי לזהות ולזהות רעלים, השוואת נתונים של ספקטרום הפיצול המתקבל על ידי ספקטרומטריית מסה עם ספריית GNPS. זה מאפשר זיהוי של רעלים ידועים אנלוגים לא ידועים המופיעים קשורים באותה רשת מולקולרית.

Introduction

פריחות ציאנובקטריאליות התגלו כבעיה סביבתית בכל רחבי העולם ב -15 השנים האחרונות¹^,². פריחות ציאנובקטריאליות נובעות מצמחיית יתר של מיקרואורגניזמים הנקראים ציאנובקטריה. הם קבוצה בולטת של מיקרואורגניזמים פוטוסינתטיים שהתאימו את עצמם לחיות במגוון רחב של סביבות, כולל אזורים טרופיים ומים קרים במיוחד. הם ידועים בהפקת פריחות גדולות המכסות משטחי מים, במיוחד בתגובה להעשרה מסיבית של חומרים מזינים, מה שמכונה תהליך eutrophication³.

לכן, ציאנובקטריה הם bioindicators מעולה של זיהום מים⁴^,⁵^,⁶. הם יכולים גם לייצר מגוון רחב של תרכובות טבעיות עם תכונות תרופתיות מעניינות⁷^,⁸. הבעיה הסביבתית הקשורה לציאנובקטריה היא הפריחה עצמה. פריחה יכולה לחסום את אור השמש לעשבים מתחת למים, לצרוך חמצן במים המובילים להריגת דגים, לייצר חלאות וריחות משטח, ולהפריע להאכלת המסנן של אורגניזמים⁹.

בנוסף, ואפילו יותר ברצינות, בשילוב מסוים של גורמים כגון טמפרטורה, חומרים מזינים (זרחן וחנקן), אור השמש (עבור הפוטוסינתזה), ו- pH של המים, פריחות ציאנובקטריאליות מפעילות ייצור רעלים; לכן, הם הופכים מזיקים לבני אדם ובעלי חיים. המחלקה הנחקרת ביותר של ציאנוקסינים מיוצרת על ידי הסוג Microcystis. אלה הם פפטידים מחזוריים הידועים תחת השם הכללי של microcystins (MCs): microcystin-LR להיות הנחקר ביותר כמו היכולת לייצר hepatoxicity חמור¹⁰. בעלי חיים ובני אדם עלולים להיחשף MCs על ידי בליעה של מי שתייה מזוהמים או מזון. ארגון הבריאות העולמי (WHO) הציע ערך microcystin-LR הכולל של 0.001 מ”ג / ליטר כקו מנחה¹¹. עם זאת, זה קשור רק גרסה אחת (כלומר, MC-LR) מתוך יותר מ 100 microcystins שהיו מבודדים עד כה.

שיטות משולבות שדווחו בעבר, כגון חישה מרחוק עם MALDI-TOF MS ניתוח¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵, התמקדו בזיהוי ריכוז של MCs. השיטות האחרונות משתמשות בחיישנים ברזולוציה נמוכה היעילים בזיהוי מרחבי פריחה רחבים בלבד; הם גם מסוגלים לחשוף רק רעלים שעבורם סטנדרטים זמינים. יתר על כן, רוב ההליכים האלה הם זמן רב, והזמן הוא גורם דרמטי לגילוי מוקדם של הפריחה כדי למנוע או למזער בעיות בטיחות. האסטרטגיה הרב-תחומית המוצעת כאן מספקת זיהוי מהיר של פריחת ציאנובקטריה וציאנוטוקסינים, לאחר 24 שעות^{בלבד 16}.

במסגרת התוכנית שנקראת MuM3, “ניטור רב תחומי, רב-ממדי ורב-פרמטרי במרחב הפיזי התלת מימדי (3D) “¹⁷^,¹⁸, אסטרטגיית זיהוי מהירה (FDS) משלבת את היתרונות של מספר טכניקות: 1) חישה מרחוק כדי לזהות את הפריחה; 2) תצפית מיקרוסקופית לגילוי מיני ציאנובקטריה; ו-3) ניתוחים אנליטיים/ביואינפורמטיים, כלומר, רשתות מולקולריות מבוססות LC-HRMS, לזיהוי ציאנוטוקסינים. התוצאות מתקבלות תוך 24 שעות.

הגישה החדשה שימושית לניטור אזורי חוף רחבים תוך זמן קצר, הימנעות מדגימה וניתוחים רבים והפחתת זמן הגילוי והעלויות. אסטרטגיה זו היא תוצאה של מחקר ויישום של גישות שונות לניטור של ציאנובקטריה ורעליהם ומשלבת את היתרונות של כל אחד מהם. באופן ספציפי, ניתוח התוצאות, הנובעות משימוש בפלטפורמות שונות (לווין, מטוסים, רחפנים) וחיישנים (MODIS, אינפרא אדום תרמי) לניתוח חישה מרחוק, כגון גישות מתודולוגיות מגוונות לזיהוי מינים ציאנובקטריאליים (מיקרוסקופ, ספקטרוסקופיית UV-Vis, ניתוח 16S) ורעלים (ניתוח LC-MS, רשתות מולקולריות), אפשרו את הבחירה בשיטה המתאימה ביותר הן עבור המתודולוגיה החדשה נוסתה ותוקפה בקמפיינים שלאחר מכן ניטור בחופי קמפניה (איטליה), במסגרת תוכנית ניטור הסוכנות להגנת הסביבה קמפניה.

איור 1: אסטרטגיית FDS. סקירה כללית של אסטרטגיית זיהוי מהיר עבור ציאנובקטריה וציאנוטוקסינים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Protocol

1. חישה מרוחקת ופרוקסימלית: רכישת נתונים וניתוחם הערה: במקרה זה, נתוני חישה מרוחקים/פרוקסימליים משמשים לסקר מאקרו-אזור ראשון ולבחירת נקודות ספציפיות של אזורי חוף לדגימה. בערכת MuM3 framework17 הזרימה הלוגית מבוססת על מודל ניטור הירארכי הכולל מספר רמות הנקראות שכבות מידע. המידע של כל רמה מבוסס על נתונים שנרכשו באמצעות חיישנים אחד או יותר הנישאים על גבי פלטפורמות הממוקמות בגבהים שונים. כל רמה מגדירה סולם מרחבי בהתאם לגובה המדידה19. קיים פוטנציאל לחיישנים מרובים בכל רמה. כמה דוגמאות הן: גלוי ליד אינפרא אדום (VNIR) ואינפרא אדום תרמי (TIR) הדמיה20 על לוויינים, מטוסים, מסוקים, מל”ט21 ועל פני השטח; ניתוחים פיזיים, כימיים וביולוגיים וכו’22 על פני השטח ובתגובה מהירה באמצעות המעבדה הניידת. הנתונים הנרכשים על ידי כל חיישן מעובדים ומשולבים לחישוב אינדקסים רב-ספקטרליים (לדוגמה, מדד צמחיית הפרש מנורמל (NDVI), מדד מי הבדל מנורמל (NDWI), אינדקס כלורופיל וכו ‘), כך שהנתונים הגולמיים מומרים לפרמטרים ופורמטים שימושיים יותר (לדוגמה, מפה נושאית). איור 2: ניתוחי חישה מרוחקים/פרוקסימליים לדגימה (שלבים 1.2). גישה רב-מפלסית ורב-חיישנית לגילוי פריחה ציאנובקטריאלית. רכישת נתונים מתבצעת על ידי לוויין (A), מטוסים (B), ו / או מזל”ט (C). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. אחזור נתוני חישה מרוחקים ופרוקסימליים אחזר נתונים מערכות הנתונים השונות של חישה מרחוק ציבוריות ופרטיות, שהופקו במיוחד עבור אחזור מבוסס תוכן וסיווג סצנה. מקורות טיפוסיים של ערכת נתונים המשמשים בשלב זה כוללים: מוצרי Landsat המסופקים על ידי הסקר הגיאולוגי של ארה”ב23, סנטינל-2,3 מוצרים המסופקים על ידי נאס”א24, ו מרכז גישה פתוחה קופרניקוס25, MODIS-Aqua26. זהה את המוצרים הזמינים עבור האזור הספציפי, טווח התאריכים ושקול את המגבלה הנגזרת מכיסוי הענן. הגדר: א) אזור העניין באמצעות ממשק משתמש גרפי ובחירת מצולע; ב) טווח התאריכים וכיסוי הענן באמצעות שדות סינון שאילתת הטקסט.הערה: גם אם דיווחים מדעיים רבים מצטטים כי ערך כיסוי ענן מקובל הוא <20%, בסוג זה של מחקר, חשוב לשים לב לכיסוי העננים האמיתי רק על פני המים, ולכן ערך האפקטיביות של אזור זה הוא <5%. בחר מוצרים הנגזרים מהפלטפורמות המתאימים ביותר לצרכים הספציפיים של המשימה. מכל שילוב של מפרט טכני לווין ומטען, ניתן להשיג מספר אוספים של מוצרים. לדוגמה, מוצרי הנתונים של נאס”א EOSDIS24 מעובדים ברמות שונות החל מרמה 0 ועד רמה 4: מוצרי רמה 0 הם נתונים גולמיים ברזולוציית מכשיר מלאה ואילו ברמות גבוהות יותר הנתונים מומרים לפרמטרים ופורמטים שימושיים יותר. בדרך כלל, רמות 0-1 זמינים, בעוד המוצרים ברמות 2-4 צריך עיבוד ספציפי הקשורים למטרות מחקר ספציפיות, כך הזמינות שלהם מוגבלת בזמן ואת האזור מכוסה. הורד את ערכת הנתונים שנבחרה של תצפיות לווין. בפירוט, בחירה בין רשימת התוצאות מהפעולה הקודמת, הורד מוצר ערכת נתונים מלא (לדוגמה, קבוצה של קבצי geo-tiff, אחד עבור כל רצועה, בתוספת מידע ומטה-נתונים אחרים) או רק רצועה אחת ספציפית.הערה: לתיאור הספציפי של כל פעולה בסיסית הכלולה בהליך של שלב 1, עיין גם הואן-הואן חן ואח ‘. 202027. עיבוד ועיבוד מראש של נתונים לניתוח והפיכתם לפרמטרים ופורמטים שימושיים יותר כדי לאפשר הקרנה ראשונה של אזור המאקרו.הערה: הפעולות הבאות (שלב 1.2) מוקדשות לעיבוד נתונים סופי כדי להפוך נתונים גולמיים המגיעים מרמות נמוכות יותר למידע ולאחר מכן למידע שימושי (רמות גבוהות יותר). שלב זה מורכב מעיבוד הנתונים הגולמיים מכל חיישן (לדוגמה, רמות מוצר 0-1) והפיכתם למוצרים ברמה גבוהה יותר (לדוגמה, רמות 2-4) ולאחר מכן, בשכבות מידע כדי ליצור פרמטרים ופורמטים שימושיים יותר (לדוגמה, מפה נושאית). מעבדים מראש נתונים גולמיים הכוללים כיול גיאומטרי ורדיומטרי. ניתן לבצע פעולה זו באמצעות תוכנה ספציפית, באופן אוטומטי או חצי אוטומטי (ללא השגחה או בפיקוח), מספקת ערכה של כלים מחוברים לעיבוד רסטר כדי לבצע סיווג קל המכבד זרימת עבודה נכונה.הערה: במחקר זה, שני כלי קוד פתוח חינם משמשים: Q-GIS 3.1428 בשילוב עם תוסף סיווג חצי אוטומטי (SCP). תוסף SCP29 מאפשר סיווג חצי אוטומטי של תמונות חישה מרחוק, מתן ערכת כלים מלאה להורדת תמונות חינם, עיבוד מראש, עיבוד שלאחר, ואת חישוב רסטר. תהליך נתונים מכוילים חישוב אינדקסים multispectral. בדרך כלל, פעולה זו מתבצעת באמצעות כלי מחשבון רסטר. החישוב של אינדקס רב-ספקטרלי מגדיר מתאם בין רצועות/שכבות שונות, וכתוצאה מכך יוצר שכבה חדשה שניתן לנהל בפלטפורמת GIS. לדוגמה, החל חיישן הדימוי היבשתי התפעולי סנטינל ו Landsat (OLI), ניתן לחשב אינדקסים multispectral כגון מדד צמחייה הבדל נורמלי (NDVI). אינדקס צמחייה משמש לאחר מכן להערכת תוכן כלורופיל30,31. לנתח את התוצאות המתקבלות מההערכה של אינדקס תוכן כלורופיל המיוצג כמו במפות נושאיות צבע שווא ולהגדיר אזור קריטי עם ריכוז כלורופיל גבוה. במחקר זה, כלורופיל-מפה נוצרת באמצעות ערכת נתונים של חיישן MODIS32, רכוב על פלטפורמות לווין טרה ואקווה. נקודות הדגימה מותאמות לשפות מקומיות שבהן רשומים ערכים חריגים.הערה: דגל פריחת האצות (המגדירים כל נקודה ספציפית) מורם בתחום החישה מרחוק כאשר ריכוז Chl-a עולה על 20 מ”ג / L33. 2. דגימות מונחות הערה: הבחירה בנקודות דגימה מונעת על ידי ניתוח שכבת חישה מרוחקת / פרוקסימלית המאפשרת לבחור כתמים באזורי חוף גדולים. אם ניקח בחשבון כי דגימה עלולה להיות מסוכנת עבור מפעילים בשל רעילות של microcystins, נהלי דגימת בטיחות נדרשים. במיוחד, יש צורך להגן על המפעילים מפני שאיפת תרסיס ומגע בעור. לאחר מכן, בצע דגימה בהתאם להליך המפורט להלן. יש ללבוש משקפי מגן להגנה על העיניים, מסכת FFP2 למניעת שאיפת אירוסול וכפפות בטיחות למניעת מגע בעור. לאסוף 0.5 L של מים משולש בכל אתר. למדוד את המליחות עבור כל מדגם באמצעות שבירה. שים טיפה של המדגם על השבירה ולקרוא את ערך המליחות במונחים של חלקים לאלף (ppt – ‰). בסוף הדגימה, ראשית לשטוף את הידיים; ואז בתורו להסיר את הכפפות, מסכה, ומשקלים מקפידים לא לגעת במשטח החיצוני של ציוד הגנה אישית. קח את הדגימה למעבדה בטמפרטורת החדר. 3. זיהוי מיני ציאנובקטריה על ידי תצפיות מיקרוסקופיות וזיהוי טקסונומי צנטריפוגה כל דגימה (≈0.5 L) ב 11,200 x g במשך 5 דקות. לחלץ supernatants כדלקמן: לשפוך 500 מ”ל של butanol בכל מדגם באמצעות משפך, להעביר את התערובת כדי להיות מופק לתוך משפך מפריד. הנח את המשפך המפריד זקוף במהדק הטבעת כדי לאפשר לשתי השכבות להיפרד. תן לשלב מימית לנקז בבקבוק ארלנמאייר. חזור על שלב זה שלוש פעמים. לאחר מכן, לרכז את השלבים האורגניים תחת ואקום ולשקול אותם. לאסוף כדורי משלב 3.1 ולנתח אותם ב 400x ו 1,000x הגדלה עם מיקרוסקופ אופטי מצויד 18 MP מצלמה דיגיטלית עבור מיקרוסקופ. חפש נוכחות של ציאנובקטריה על בסיס התכונות המורפולוגיות שלהם: צבע כחול-ירוק, צורת תא וגודל מאפשרים לזהות ציאנובקטריה בקרב מיקרואורגניזמים אחרים. לזהות את המין באמצעות ניתוח טקסונומי על ידי תצפית מיקרוסקופית, על פי ההליך המתואר Komarék ואח ‘. 201434.הערה: ניתן לבצע ניתוח מטגנומי משלים של 16S על מנת לזהות מסה ציאנובקטריאלית3. לדלל aliquot של כדורי עם 10 מ”ל של מי ים / מים מתוקים BG11 מדיה, על פי המליחות שלה, לטיפוח. 4. זיהוי של ציאנוקסינים מיצוי דגימות עם ממיסים אורגניים שים כל מדגם של גלולה בבקבוק sonicate במשך 5 דקות באמצעות אמבט קרח. לאחר מכן, הוסיפו 50 מ”ל של MeOH טרי ונערו בעדינות. סנן את הפתרון באמצעות מסנן נייר ואסוף את הסינון בבקבוקון תחתון עגול. חזור על שלב זה פעמיים. לאחר מכן, לחלץ את כדורי הוספת תערובת 50 מ”ל של MeOH / DCM פעמיים (1:1, 50 מ”ל), ופעמיים באמצעות 100% DCM (x2, 50 מ”ל)35. סמן כל בקבוקון תחתון עגול בהתאמה, כ”תמצית MeOH”, “תמצית MeOH/DCM” ו”תמצית DCM”, והתרכז תחת ואקום. נתח כל תמצית אורגנית (MeOH, MeOH/DCM, DCM) באמצעות LC-HRMS/MS. ניתוח LC-HRMS/MS הכנת דגימות LC-HRMS ו-LC-HRMS/MS: המסת כל דגימה באמצעות MeOH ≥ 99.9% כדי לקבל ריכוז סופי של 10 מ”ג/מ”ל. נתח כל דגימה באמצעות ספקטרומטר מסה ESI ברזולוציה גבוהה בשילוב עם מערכת HPLC (מערכת LC-HRMS/MS). עבוד על HPLC עם עמודת C18 של 5 מיקרומטר (100 x 2.10 מ”מ), בטמפרטורת החדר. השתמש elution הדרגתי עם H2O (בתוספת 0.1% HCOOH) ו MeOHat 200 μL מינימום-1. התוכנית ההדרגתית היא: 10% MeOH למשך 3 דקות, 10% עד 100% MeOH למשך 30 דקות, 100% MeOH למשך 7 דקות. רכישת נתונים. איסוף נתונים במצב רכישה תלוי נתונים (DDA): 10 היונים האינטנסיביים ביותר של ספקטרום מסת סריקה מלאה צריכים להיות נתונים לניתוח ספקטרומטריית מסה דו-מושבית ברזולוציה גבוהה (HRMS/MS). רכוש סריקות HRMS/MS עבור יונים נבחרים עם פיצול CID, רוחב בידוד של 2.0, אנרגיית התנגשות מנורמלת של 35, הפעלה Q של 0.250 וזמן הפעלה של 30 אלפיות השנייה. ניתוחים ביואינפורמטיים ורשתות מולקולריות נתח תבניות פיצול עבור כל יון אינטנסיבי באמצעות תוכנה ספציפית ל- MS. השתמש ב- MS-Cluster כדי לאשכול את הנתונים (עמידות במסה המהווה אב של 1.0 Da וסובלנות יון קטע MS/MS של 0.5 Da). ספקטרום קונצנזוס המכיל פחות מ 2 ספקטרום מסולקים. נתח נתוני MS/MS על ידי GNPS (גלובל מוצרים טבעיים חברתיים36) עבור רשתות מולקולריות. זוג להשוות ספקטרום קונצנזוס וגם עם אלה שדווחו בספריות GNPS-Mass-Ive. דמיינו את הרשת המתקבלת37.הערה: עבור נטוורקינג מולקולרי אנא עיין Sigrist ואח ‘. 202038. איור 3: שלבי מעבדה של FDS (3.4). ייצוג חזותי של הפעילויות העיקריות המתבצעות במעבדה לאחר הדגימה (שלבים 3 ו-4). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Representative Results

במחקר ראשון3, ארבעה אתרים מושפעים אנתרופוגנית לאורך חוף קמפניה באיטליה SW נצפו באמצעות לווין Landsat 8 ומטוסים במהלך קיץ 2015. Landsat 8 חיישן תמונה יבשתית מבצעית (OLI) ואת המצלמה multispectral המטוס מותר ליצור הבדל מנורמל אינדקס מים (NDWI) תמונות עבור האזורים, ולכן, כדי לחשוף את נוכחותם של קהילות cyanobacterial. הרכב הקהילה הציאנובקטריאלי נקבע באמצעות ניתוחים ספקטרופוטומטריים לגילוי phycocyanin פיגמנט ציאנובקטריאלי (PC). לאחר מכן, ניתוח מטגנומי משלים 16S מותר לזהות מסה ציאנובקטריאלי. האינדקס והסיווג של התמונה הרב-ספקטרלית הפשוטה באמצעות פלטפורמות לווין/אוויר בשילוב עם ניתוחים מטגנומיים היו יעילים בזיהוי נוכחות של ציאנובקטריה השייכת לג’נריישן הקשורים לתנאים אוטרופיים חזקים (כגון לפטולינגביה sp., Pseudooscillatoria sp.), בשלב מוקדם של פריחה. במחקר שני14, גישת FDS נבדקה במהלך האביב / קיץ 2017. נתוני לוויין שימשו כרמה היחידה של חישה מרחוק. בפירוט, נתונים שנרכשו על ידי חיישן MODerate Image Spectroradiometer (MODIS), רכוב על פלטפורמות לוויין טרה ואקווה, אפשרו כימות של כלורופיל-a (Chl-a) בגופי המים לאורך חופי קמפניה ונסעו הבחירה של עשרה כתמי דגימה. דגימות עובדו במעבדה על ידי תצפית מיקרוסקופית וזיהוי טקסונומי, ולאחר מכן שחולצו עם ממיסים אורגניים. תמציות אורגניות עובדו על ידי ניתוח LC-MS-MS. נתונים שהתקבלו על ידי MS-MS נותחו באמצעות גישה ביואינפורמטית, באמצעות פלטפורמת GNPS כדי ליצור רשת של מולקולות. הרשת נותחה כדי לזהות ולזהות רעלנים המשווים נתונים של ספקטרום הפיצול המתקבל על ידי ספקטרומטריית מסה עם ספריית GNPS. זה מותר לזהות רעלים ידועים אנלוגים לא ידועים שיופיעו קשורים באותה רשת מולקולרית. באופן ספציפי, Lyngbyatoxin A, dermatotoxins lipophilic, זוהה בכל דגימות המים ודגימות דו-כיווניות; ב Lyngbyatoxin אשכול מולקולרי, צמתים שאינם קשורים לכל תרכובות ידועות של משפחת lyngbyatoxins היו גם נוכחים, מה שמרמז על נוכחות של אנלוגים לינגביא רעלן לא ידוע. בדגימות לא התגלו מיקרוציסטינים ורעלים אחרים. כל התוצאות התקבלו תוך 24 שעות. איור 4: תוצאות מייצגות FDS. דוגמה ליישום אסטרטגיית FDS בחוף קמפניה (איטליה). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

במהלך השנים האחרונות, הצוות שלנו בדק ואימת מספר גישות שונות שאפשרו לפענח את נוכחותם של ציאנובקטריה וציאנוטוקסינים בגופי מים ובייבלבים. האסטרטגיה המפותחת החדשה מייצגת את התוצאה של מחקרים אלה. הטכניקות והטכנולוגיות האופטימליות המתאימות להיקף הזיהוי המהיר נאספות תחת כובעו של הליך ייחודי הממקסם את האפקטיביות של כל צעד ושלב. אזור היעד, הרחבת הפריחה ושלב הגידול הם הכוח המניע לבחירת שיטות וטכנולוגיות מתאימות לשימוש.

כאשר גילוי מהיר של ציאנובקטריה וציאנוקסינים הוא בראש סדר העדיפויות, האסטרטגיה יעילה בהפחתת המספר הכולל לארבעה שלבים עיקריים: (1) חישה מרחוק ופרוקסימלי וניתוח נתונים לסקר ראשון, לוקליזציה של אתרים והגדרת דפוס פריחה והרחבה; (2) דגימה מודרכת; (3) תצפית מיקרוסקופית וניתוח טקסונומי; (4) ניתוח כימי ורשת מולקולרית של נתוני LC-MS לדרפליציה של דגימות המים וגילוי מהיר של ציאנוקסינים.

לגבי הצעד הראשון, גם אם הזמינות של נתונים שנרכשו על ידי שרשרת שלמה של פלטפורמות המכסות את כל השכבות של גישת ניטור היררכי יהיה הפתרון הטוב ביותר כדי restitute חזון מלא של התרחיש מנותח, לעתים קרובות רק שכבת מידע אחת יכולה להניע את פעולת הסקר באזור ולהתמקד ביעילות בנקודות החמות לבצע פעולות דגימה in-situ. על פי החוויות המדווחות שבהן נרכשו נתונים באמצעות לוויינים, מטוסים, מסוקים, כלי טיס בלתי מאוישים, הפתרון התואם לחלוטין את הצרכים הנדרשים על ידי אסטרטגיית הגילוי המהירה הוא השימוש במוצרי הלוויין היחידים.

בנוסף, שכבות המידע הנובעות ממשימות המבוצעות על ידי פלטפורמות הטסות בגבהים נמוכים יותר מאשר לוויינים (למשל, מטוסים, מסוקים, כלי טיס בלתי מאוישים) מספקות מידע ברזולוציה גבוהה אך אלה יקרות מאוד וגם דורשות זמן רב יותר להשלמת תהליך הרכישה המלא הכולל גם הגדרת תוכנית טיסה ואישור.

לאחר שהנקודות שיש לדגימות נבחרו (שלב 2), ניתוחים אנליטיים/ביואינפורמטיים (נטוורקינג מולקולרי של נתוני LC-MS) הוא הכלי לדרפליציה מהירה של דגימות המים וגילוי מהיר של ציאנוקסינים (שלבים 3 ו -4). ניתוח מטגנומי 16S לוקח לפחות 2 שבועות של עבודה. יתר על כן, גם כאשר מינים ציאנובקטריאליים רעילים באופן כללי מזוהים, ייצור הרעלן שלהם אינו מוכח. מאותה סיבה, תצפית מיקרוסקופית אינה עצמה מספיקה כדי לחשוף את נוכחותם של ציאנובקטריה רעילה. כמובן, ניתוח טרשת נפוצה ורשת מולקולרית יש כמה מגבלות; הם יעילים למדי אם תרכובות של עניין (למשל, רעלים) מיוננת היטב בתנאים החלים, אם הם בסכום מספיק כדי להתגלות. לצורך זיהוי וניטור רעלן ציאנובקטריאלי ידוע, רשת מולקולרית מבוססת טרשת נפוצה מייצגת למעשה את אחת הטכנולוגיות החזקות והאמינות יותר.

לכן, גישה זו מוכיחה להיות שימושי למדי כאשר יש צורך בזיהוי מהיר של ציאנובקטריה וציאנוטוקסינים קשורים; יתר על כן, כימות של פריחה ציאנובקטריאלית ורעלן על פני מרחב וזמן אפשרי גם על ידי אסטרטגיה זו כדי למנוע בעיות של קהילות בריאות שעלולות להתעורר על ידי פריחות רעילות ציאנובקטריאליות גדולות.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי “Centro di Riferimento Regionale per la Sicurezza Sanitaria del Pescato (CRiSSaP)” במסגרת הפרויקט “Attività pilota di Monitoraggio di Cianobatteri nella faella fascia costiera אזור דלה קמפניה”, ובוצע בשיתוף פעולה עם הסוכנות להגנת הסביבה באזור קמפניה, איטליה (ARPAC), “Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno / Osservatorio Regionale לכל לה סיקורצה אלימנטרה” (IZSM /ORSA), אוניברסיטת נאפולי “פדריקו II” – המחלקה לרפואה וטרינרית וייצור בעלי חיים, השופט פרופ ‘ א. אנסטסיו).

Materials

10X Vitamin mix			Nicotinic acid 100 mg/100 mL; PABA 10 mg/100 mL; Biotin 1 mg/100 mL; Thiamine 200 mg/100 mL; B₁₂ 1 mg/100 mL; Folic Acid 1 mg/100 mL; i-inositol 1 mg/100 mL; Ca-pantothenate 100 mg/100 mL
1-BuOH	Sigma-Aldrich	33065.2.5L-R
BG11 stock solution			Na₂EDTA 20 mg/L; Ferric ammonium citrate 120 mg/L; Citric acid·1H₂O 120 mg/L; CaCl₂·2H₂O 700 mg/L, MgSO₄·7H₂O 1.5 g/L, K₂HPO₄·3H₂O 800 mg/L, NiSO₄(NH₄)2SO₄·6H₂O (0.1 mM stock) 5 mL; Na₂SeO₄ (0.1 mM stock) 2 mL, Nitsch's Solution 20 mL
Centrifuge	Hermle	Z36HK
CHCl₃	Honeywell	32211.2.5L
H₂O	Sigma-Aldrich	34877.2.5L
Kinetex C18 cloumn	Phenomenex
LTQ Orbitrap XL high-resolution ESI mass spectrometer coupled to a U3000 HPLC system	Thermo
MeOH	Honeywell	32213.2.5L
Microscope equipped with an OMAX 18 MP CMOS camera	Optech	Biostar B3
Multiband camera	Intergraph DMC
Nitsch's Solution			H₃BO₃0.5 g/L MnSO₄· H₂O 2.28 g/L ZnSO₄·7H₂O 0.5 g/L CuSO₄·5H₂O 0.025 g/L COCl₂·6H₂O 0.135 g/L Na₂MoO₄·2H₂O 0.025 g/L
Refractomer mr 100 ATC	AQL
SWBG11 medium			BG11 stock solution 50 mL/L; Instant Ocean 33 g/L; Water 950 mL/L 10X; Vitamin mix 100 µL/L

References

Tamele, I. J., Silva, M., Vasconcelos, V. The incidence of marine toxins and the associated seafood poisoning episodes in the African countries of the Indian ocean and the Red sea. Toxins. 11 (1), 25-48 (2019).
Lürling, M., Faassen, E. J. Dog poisonings associated with a Microcystis aeruginosa bloom in the Netherlands. Toxins. 5 (3), 556-567 (2013).
O’Neil, J. M., Davis, T. W., Burford, M. A., Gobler, C. J. The rise of harmful cyanobacteria blooms: The potential roles of eutrophication and climate change. Harmful Algae. 14, 313-334 (2012).
Teta, R., et al. Cyanobacteria as indicators of water quality in Campania coasts, Italy: A monitoring strategy combining remote/proximal sensing and in situ data. Environmental Research Letters. 12 (2), (2017).
Teta, R. Bioindicators as a tool in environmental impact assessment: Cyanobacteria as a sentinel of pollution. International Journal of Sustainable Development and Planning. 14 (1), 1-8 (2019).
Teta, R., Della Sala, G., Mangoni, A., Lega, M., Costantino, V. Tracing cyanobacterial blooms to assess the impact of wastewaters discharges on coastal areas and lakes. International Journal of Sustainable Development and Planning. 11 (5), 804-811 (2016).
Teta, R., et al. A joint molecular networking study of a: Smenospongia sponge and a cyanobacterial bloom revealed new antiproliferative chlorinated polyketides. Organic Chemistry Frontiers. 6 (11), 1762-1774 (2019).
Singh, R. K., Tiwari, S. P., Rai, A. K., Mohapatra, T. M. Cyanobacteria: an emerging source for drug discovery. Journal of Antibiotics. 64 (6), 401-412 (2011).
Huisman, J., et al. Cyanobacterial blooms. Nature Reviews Microbiology. 16 (8), 471-483 (2018).
Gupta, N., Pant, S. C., Vijayaraghavan, R., Rao, P. V. L. Comparative toxicity evaluation of cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin variants (LR, RR, YR) in mice. Toxicology. 188 (2-3), 285-296 (2003).
WHO. Cyanobacterial toxins: Microcystin-LR in drinking water. Background document for development of WHO Guidelines for Drinking-Water Quality. WHO. 2, (1998).
Agha, R., Cirés, S., Wörmer, L., Domínguez, J. A., Quesada, A. Multi-scale strategies for the monitoring of freshwater cyanobacteria: Reducing the sources of uncertainty. Water Research. 46 (9), 3043-3053 (2012).
Giménez-Campillo, C. Determination of cyanotoxins and phycotoxins in seawater and algae-based food supplements using ionic liquids and liquid chromatography with time-of-flight mass spectrometry. Toxins. 11 (10), 610 (2019).
Sanseverino, I., António, D. C., Loos, R., Lettieri, T. Cyanotoxins: methods and approaches for their analysis and detection. JRC Technical Reports. , (2017).
Teta, R. Combined LC-MS/MS and molecular networking approach reveals new cyanotoxins from the 2014 cyanobacterial bloom in Green Lake, Seattle. Environmental Science and Technology. 49 (24), 14301-14310 (2015).
Esposito, G., et al. A fast detection strategy for cyanobacterial blooms and associated cyanotoxins (FDSCC) reveals the occurrence of lyngbyatoxin A in campania (South Italy). Chemosphere. 225, 342-351 (2019).
Lega, M., Casazza, M., Teta, R., Zappa, C. J. Environmental impact assessment: a multilevel, multi-parametric framework for coastal waters. International Journal of Sustainable Development and Planning. 13 (8), 1041-1049 (2018).
Di Fiore, V. Integrated hierarchical geo-environmental survey strategy applied to the detection and investigation of an illegal landfill: A case study in the Campania Region (Southern Italy). Forensic Science International. 279, 96-105 (2017).
Gargiulo, F., Persechino, G., Lega, M., Errico, A. IDES project: A new effective tool for safety and security in the environment. Lecture Notes in Computer Science (including subseries Lecture Notes in Artificial Intelligence and Lecture Notes in Bioinformatics). , (2013).
Ferrara, C., Lega, M., Fusco, G., Bishop, P., Endreny, T. Characterization of terrestrial discharges into coastal waters with thermal imagery from a hierarchical monitoring program. Water. 9 (7), (2017).
Alfeo, A. L., Cimino, M. G. C. A., De Francesco, N., Lega, M., Vaglini, G. Design and simulation of the emergent behavior of small drones swarming for distributed target localization. Journal of Computational Science. 29, 19-33 (2018).
Casazza, M., Lega, M., Liu, G., Ulgiati, S., Endreny, T. A. Aerosol pollution, including eroded soils, intensifies cloud growth, precipitation, and soil erosion: a review. Journal of Cleaner Production. 189, 135-144 (2018).
. U.S. Geological Survey Available from: https://ers.cr.usgs.gov (2020)
. NASA Earthdata Available from: https://urs.earthdata.nasa.gov (2020)
. Copernicus Opern Access Hub Available from: https://scihub.copernicus.eu/apihub (2020)
Chen, H. -. H., Tang, R., Zhang, H. -. R., Yu, Y., Wang, Y. Investigating the relationship between sea surface chlorophyll and major features of the south china sea with satellite information. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), (2020).
. QGIS Available from: https://www.qgis.org/it/site/ (2020)
. Semi-automatic classification plugin documentation release 4.8.0.1 Available from: https://manualzz.com/doc/7130012/semi-automatic-classification-plugin-documentation (2016)
Rouse, J. W., Hass, R. H., Schell, J. A., Deering, D. W. Monitoring vegetation systems in the great plains with ERTS. Third Earth Resources Technology Satellite (ERTS) Symposium. 1, 309-317 (1973).
Carmona, F., Rivas, R., Fonnegra, D. C. Vegetation index to estimate chlorophyll content from multispectral remote sensing data. European Journal of Remote Sensing. 48 (1), 319-326 (2015).
Savtchenko, A., et al. MODIS data from terra and aqua satellites. International Geoscience and Remote Sensing Symposium (IGARSS). 5, 3028-3030 (2003).
Binding, C. E., Greenberg, T. A., McCullough, G., Watson, S. B., Page, E. An analysis of satellite-derived chlorophyll and algal bloom indices on Lake Winnipeg. Journal of Great Lakes Research. 44 (3), 436-446 (2018).
Komárek, J., Kaštovský, J., Mareš, J., Johansen, J. R. Taxonomic classification of cyanoprokaryotes (cyanobacterial genera) 2014, using a polyphasic approach. Preslia. 86, 295-335 (2014).
Esposito, G., et al. Chlorinated thiazole-containing polyketide-peptides from the caribbean sponge smenospongia conulosa: structure elucidation on microgram scale. European Journal of Organic Chemistry. 2016 (16), 2871-2875 (2016).
Shannon, P. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Research. 13 (11), 2498-2504 (2003).
Sigrist, R., Paulo, B. S., Angolini, C. F. F., De Oliveira, L. G. Mass spectrometry-guided genome mining as a tool to uncover novel natural products. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Teta, R., Esposito, G., De Sterlich, C., Lega, M., Costantino, V. Early Detection of Cyanobacterial Blooms and Associated Cyanotoxins using Fast Detection Strategy. J. Vis. Exp. (168), e61889, doi:10.3791/61889 (2021).

Automatically Generated