Early Detection of Cyanobacterial Blooms and Associated Cyanotoxins using Fast Detection Strategy

Roberta Teta; Germana Esposito; Carlo De Sterlich; Massimiliano Lega; Valeria Costantino

doi:10.3791/61889

JoVE Journal > Chemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Chemistry

الكشف المبكر عن الأزهار السيانوكتيرية والسموم السيانوتوسينية المرتبطة بها باستخدام استراتيجية الكشف السريع

Published: February 25, 2021

doi:

10.3791/61889

Roberta Teta¹, Germana Esposito¹, Carlo De Sterlich², Massimiliano Lega*³, Valeria Costantino*¹

¹TheBlueChemistryLab, Department of Pharmacy,University of Naples Federico II, ²Department of Public Health,University of Naples Federico II, ³Department of Engineering,University Parthenope

Summary

ويرد هنا وصف لاستراتيجية سريعة متعددة التخصصات للكشف المبكر عن الأزهار السيانوبكتيرية والسموم السيانوتوسينية المرتبطة بها. وهو يسمح بالكشف عن البكتيريا الزرقاء والسموم السيانوتوسينية ذات الصلة في عينات المياه وفي المصفوفات العضوية، مثل العينات ثنائية الصمام، في 24 ساعة.

Abstract

يتم تحقيق الكشف السريع عن البكتيريا الزرقاء والسموم السيانوتوسينية باستخدام استراتيجية الكشف السريع (FDS). هناك حاجة فقط 24 ساعة لكشف وجود البكتيريا الزرقاء والسموم الزرقاء ذات الصلة في عينات المياه وفي مصفوفة عضوية، مثل مقتطفات ثنائية الصمام. تجمع FDS بين تقنيات الاستشعار عن بعد/القريبة مع التحليلات التحليلية/المعلوماتية الحيوية. ويتم اختيار أماكن أخذ العينات من خلال الرصد المتعدد التخصصات والمقاييس والمقاييس في الفضاء المادي ثلاثي الأبعاد، بما في ذلك الاستشعار عن بعد. يتم إجراء المراقبة المجهرية والتحليل التصنيفي للعينات في الإعداد المختبري ، مما يسمح بتحديد الأنواع البكتيرية السيانوبكتيرية. ثم يتم استخراج العينات مع المذيبات العضوية ومعالجتها مع LC-MS/MS. يتم تحليل البيانات التي تم الحصول عليها من قبل MS / MS باستخدام نهج المعلوماتية الحيوية باستخدام منصة على الانترنت المنتجات الطبيعية العالمية الاجتماعية (GNPS) لإنشاء شبكة من الجزيئات. وتحلل هذه الشبكات لكشف وتحديد السموم، ومقارنة بيانات أطياف التجزؤ التي تم الحصول عليها عن طريق قياس الطيف الكتلي مع مكتبة الشبكات الوطنية لغازات السمية. وهذا يسمح للكشف عن السموم المعروفة ونظائرها غير معروف التي تظهر ذات الصلة في نفس الشبكة الجزيئية.

Introduction

ظهرت الأزهار السيانوكتيرية كمشكلة بيئية في جميع أنحاء العالم في السنوات ال 15 الماضية¹^،². تزهر البكتيريا الزرقاء ويرجع ذلك إلى فرط نمو الكائنات الحية الدقيقة اسمه البكتيريا الزرقاء. وهي مجموعة واضحة من الكائنات الحية الدقيقة الضوئية التي تكيفت للعيش في مجموعة كبيرة من البيئات، بما في ذلك المناطق الاستوائية والمياه الباردة للغاية. ومن المعروف أنها لإنتاج تزهر كبيرة تغطي أسطح المياه، وخاصة ردا على إثراء هائل من المواد الغذائية، ما يسمى عملية eutrophication³.

لذلك ، البكتيريا الزرقاء هي الأجهزة الحيوية ممتازة من تلوث المياه⁴^،⁵^،⁶. كما أنها يمكن أن تنتج مجموعة واسعة من المركبات الطبيعية مع خصائص الدوائية مثيرة للاهتمام⁷^،⁸. المشكلة البيئية المتعلقة بالبكتيريا الزرقاء هي الأزهار نفسها. يمكن أن تزهر حجب أشعة الشمس إلى الأعشاب تحت الماء، وتستهلك الأكسجين في المياه مما يؤدي إلى يقتل الأسماك، وإنتاج حثالة السطح والروائح، وتتداخل مع تغذية مرشح من الكائنات الحية⁹.

بالإضافة إلى ذلك ، بل وأكثر خطورة ، في مجموعة محددة من العوامل مثل درجة الحرارة والمواد المغذية (الفوسفور والنيتروجين) ، وأشعة الشمس (لفترة التمثيل الضوئي) ، ودرجة الحموضة في الماء ، فإن الأزهار السيانوبكتيرية تؤدي إلى إنتاج السموم ؛ لذلك ، فإنها تصبح ضارة للبشر والحيوانات. يتم إنتاج الفئة الأكثر دراسة من السموم الزرقاء من قبل جنس Microcystis. هذه هي الببتيدات الدورية المعروفة تحت الاسم العام للميكروسيتينات (MCs): microcystin-LR كونها الأكثر دراسة على أنها قادرة على إنتاج السمية الكبدية الشديدة¹⁰. وقد تتعرض الحيوانات والبشر لمركبات الكربون المغسولة عن طريق تناول مياه الشرب أو الأغذية الملوثة. اقترحت منظمة الصحة العالمية (WHO) قيمة إجمالية للميكروسيتين-LR تبلغ 0.001 ملغم/لتر كمبدأ توجيهي¹¹. ومع ذلك، يرتبط هذا فقط بمتغير واحد (أي MC-LR) من بين أكثر من 100 ميكروسيتين تم عزلها حتى الآن.

وقد ركزت الأساليب المشتركة المبلغ عنها سابقا، مثل الاستشعار عن بعد مع تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد MALDI-TOF¹²^و¹³^و¹⁴^و^15،على اكتشاف تركيز الشركات متعددة التخصصات. وتستخدم أحدث الطرق أجهزة استشعار منخفضة الاستبانة تكون فعالة في الكشف عن مساحات واسعة فقط من الإزهار؛ كما أنها قادرة على الكشف عن السموم فقط التي تتوفر المعايير. وعلاوة على ذلك، فإن معظم هذه الإجراءات تستغرق وقتا طويلا، والوقت عامل مثير للكشف المبكر عن الإزهار لمنع أو تقليل مشاكل السلامة. الاستراتيجية متعددة التخصصات المقترحة هنا يوفر الكشف السريع عن البكتيريا الزرقاء تزهر وسيانوتوسينات، بعد 24 ساعة فقط¹⁶.

في إطار البرنامج المسمى MuM3 ، “متعدد التخصصات ، متعدد النطاقات والبارامترية الرصد في الفضاء المادي ثلاثي الأبعاد (3D) “¹⁷^،¹⁸، استراتيجية الكشف السريع (FDS) يجمع بين مزايا عدة تقنيات : 1) الاستشعار عن بعد للكشف عن ازهر ؛ 2) المراقبة المجهرية للكشف عن الأنواع البكتيريا الزرقاء؛ و 3) التحليلات التحليلية / المعلوماتية الحيوية ، وهي الشبكات الجزيئية المستندة إلى LC -HRMS ، للكشف عن السموم الزرقاء. يتم الحصول على النتائج في غضون 24 ساعة.

والنهج الجديد مفيد لرصد المناطق الساحلية الواسعة في وقت قصير، وتجنب العديد من العينات والتحليلات، وتقليل وقت الكشف والتكاليف. هذه الاستراتيجية هي نتيجة لدراسة وتطبيق نهج مختلفة لرصد البكتيريا الزرقاء والسموم ويجمع بين مزايا كل واحد منهم. وعلى وجه التحديد، أتاح تحليل النتائج، المتأتية من استخدام منصات مختلفة (السواتل والطائرات والطائرات بدون طيار) وأجهزة الاستشعار (MODIS، والأشعة تحت الحمراء الحرارية) لتحليل الاستشعار عن بعد، مثل النهج المنهجية المتنوعة لتحديد الأنواع السيانوبكتيرية (المجهر، والتحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية- اللزوجة، وتحليل 16S) والسموم (تحليل LC-MS، والشبكات الجزيئية)، اختيار الطريقة الأنسب للأغراض المحددة والعامة على حد سواء. وقد جربت المنهجية الجديدة وتثبت صحتها في حملات الرصد اللاحقة على سواحل كامبانيا (إيطاليا)، في إطار برنامج رصد وكالة حماية البيئة في كامبانيا.

الشكل 1: استراتيجية FDS. لمحة عامة عن استراتيجية الكشف السريع للبكتيريا الزرقاء والسموم السيانوتوسينية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Protocol

1. الاستشعار عن بعد ووكالة: الحصول على البيانات وتحليلها ملاحظة: في هذه الحالة، تستخدم بيانات الاستشعار عن بعد/القريبة لإجراء أول مسح لمنطقة الماكرو ولتحديد بقع محددة من المناطق الساحلية التي سيتم أخذ عينات منها. في إطار عمل MuM317 مخطط يستند تدفق المنطق على نموذج مراقبة هرمي يتضمن عدة مستويات تسمى طبقات المعلومات. وتستند المعلومات الخاصة بكل مستوى إلى البيانات المكتسبة باستخدام جهاز استشعار أو أكثر يحمل على متن منصات تقع على ارتفاعات مختلفة. كل مستوى يحدد مقياس المكانية اعتمادا على ارتفاع القياس19. هناك إمكانية لأجهزة استشعار متعددة في كل مستوى. ومن الأمثلة على ذلك: التصوير بالأشعة تحت الحمراء القريبة من الأشعة تحت الحمراء (VNIR) والأشعة تحت الحمراء الحرارية (TIR)20 على السواتل والطائرات والمروحيات والطائرات بدون طيار21 وعلى السطح؛ التحليلات الفيزيائية والكيميائية والبيولوجية، وما إلى ذلك22 على السطح وفي استجابة سريعة باستخدام المختبر المتنقل. تتم معالجة البيانات التي تم الحصول عليها من قبل كل جهاز استشعار ودمجها لحساب الفهارس متعددة الأطياف (على سبيل المثال، مؤشر النباتات الفرق العادي (NDVI)، مؤشر المياه الفرق العادي (NDWI)، مؤشر الكلوروفل، الخ)، وبالتالي يتم تحويل البيانات الخام إلى معلمات وأشكال أكثر فائدة (على سبيل المثال، خريطة موضوعية). الشكل 2:تحليلات الاستشعار عن بعد/القريبة لأخذ العينات (الخطوات 1-2). نهج متعدد المستويات وأجهزة الاستشعار للكشف عن إزهار البكتيريا الزرقاء. يتم الحصول على البيانات بواسطة الأقمار الصناعية (A) ، الطائرات (B) ، و / أو الطائرة بدون طيار (C). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. استرجاع بيانات الاستشعار عن بعد والوكالة استرجاع البيانات من مختلف مجموعات بيانات الاستشعار عن بعد العامة والخاصة، التي تنتج خصيصا للاسترجاع القائم على المحتوى وتصنيف المشاهد. وتشمل مصادر مجموعة البيانات النموذجية المستخدمة في هذه الخطوة: منتجات لاندسات التي تقدمها هيئة المسح الجيولوجي الأمريكية23، والمنتجات Sentinel-2،3 التي تقدمها وكالة ناسا24، وCopernicus Open Access Hub25، MODIS-Aqua26. حدد المنتجات المتوفرة للمنطقة المحددة ونطاق التواريخ، و فكر في الحد الذي يستمده الغطاء السحابي. تعريف: أ) المنطقة ذات الاهتمام باستخدام واجهة المستخدم الرسومية واختيار المضلع؛ B) نطاق التواريخ والتغطية السحابية باستخدام حقول تصفية استعلام النص.ملاحظة: حتى لو ذكرت العديد من التقارير العلمية أن قيمة الغطاء السحابي المقبولة هي <20٪، في هذا النوع من الأبحاث، من المهم الانتباه إلى الغطاء السحابي الحقيقي فقط على سطح الماء، وبالتالي فإن قيمة فعالية هذه المنطقة هي <5٪. اختيار المنتجات المستمدة من منصات أفضل المناسب للاحتياجات المحددة للبعثة. من كل مجموعة من المواصفات التقنية للأقمار الصناعية والحمولة ، من الممكن الحصول على عدة مجموعات من المنتجات. فعلى سبيل المثال، تتم معالجة منتجات البيانات EOSDIS24 التابعة لوكالة ناسا على مستويات مختلفة تتراوح بين المستوى 0 والمستوى 4: منتجات المستوى 0 هي بيانات أولية بدقة كاملة للأجهزة بينما يتم تحويل البيانات إلى معلمات وأشكال أكثر فائدة عند المستويات الأعلى. عادة ما تكون المستويات 0-1 متوفرة، في حين أن المنتجات في المستويات 2-4 تحتاج إلى معالجة محددة تتعلق بأهداف بحثية محددة، وبالتالي فإن توافرها محدود في الوقت المناسب والمنطقة المشمولة. تحميل مجموعة البيانات المختارة من الملاحظات الساتلية. بالتفصيل، يمكنك التحديد من بين قائمة النتائج من الإجراء السابق، أو تنزيل منتج مجموعة بيانات كاملة (على سبيل المثال، مجموعة من ملفات geo-tiff، واحدة لكل نطاق، بالإضافة إلى معلومات وبيانات تعريف أخرى) أو نطاق واحد محدد فقط.ملاحظة: للحصول على وصف محدد لكل إجراء أساسي مدرج في إجراء الخطوة 1، يرجى الرجوع أيضا إلى Huan-Huan Chen وآخرون 202027. تجهيز ومعالجة البيانات مسبقا للتحليل والتحول إلى معلمات وأشكال أكثر فائدة للسماح بإجراء أول فحص للمنطقة الكلية.ملاحظة: الإجراءات التالية (الخطوة 1.2) مخصصة لمعالجة البيانات النهائية لتحويل البيانات الأولية القادمة من المستويات الدنيا إلى معلومات ثم إلى معلومات مفيدة (مستويات أعلى). وتتألف هذه الخطوة من معالجة البيانات الأولية من كل جهاز استشعار (على سبيل المثال، مستويات المنتج 0-1) والتحول إلى منتجات ذات مستوى أعلى (مثل المستويات 2-4)، ثم في طبقات المعلومات لتوليد معلمات وأشكال أكثر فائدة (مثل الخريطة المواضيعية). البيانات الأولية قبل العملية التي تنطوي على معايرة هندسية وإيمترية. يمكن تنفيذ هذا الإجراء باستخدام برامج محددة توفر بطريقة تلقائية أو شبه تلقائية (غير خاضعة للرقابة أو تحت الإشراف) مجموعة من الأدوات المتصلة لمعالجة النقطية من أجل إجراء تصنيف سهل يحترم سير العمل الصحيح.ملاحظة: في هذا البحث، يتم استخدام أداتين مفتوحتي المصدر مجانا: Q-GIS 3.1428 جنبا إلى جنب مع البرنامج المساعد للتصنيف شبه التلقائي (SCP). البرنامج المساعد SCP29 يسمح للتصنيف شبه التلقائي للصور الاستشعار عن بعد، وتوفير مجموعة أداة كاملة لتحميل الصور مجانا، وتجهيز ما قبل، ومعالجة ما بعد، وحساب النقطية. معالجة حساب البيانات المحسوبة متعددة الأطياف. بشكل عام، يتم تنفيذ هذا الإجراء باستخدام أداة حاسبة النقطية. ويحدد حساب مؤشر متعدد الأطياف وجود ارتباط بين نطاقات/طبقات مختلفة تولد نتيجة لذلك طبقة جديدة يمكن إدارتها على منصة نظم المعلومات الجغرافية. على سبيل المثال، بدءا من جهاز استشعار صور الأرض التشغيلي Sentinel و Landsat (OLI)، من الممكن حساب الفهارس متعددة الأطياف مثل مؤشر الفرق النباتي (NDVI). ثم يستخدم مؤشر الغطاء النباتي لتقدير محتوى الكلوروفل30،31. تحليل النتائج التي تم الحصول عليها من تقدير مؤشر محتوى الكلوروفل ممثلة كما هو الحال في خرائط موضوعية ملونة كاذبة وتحديد المنطقة الحرجة مع تركيز الكلوروفل عالية. في هذه الدراسة، يتم إنشاء كلوروفل-a خريطة باستخدام مجموعة بيانات من أجهزة الاستشعار MODIS32،التي شنت على منصات الأقمار الصناعية تيرا وأكوا. يتم ترجمة بقع أخذ العينات حيث يتم تسجيل قيم غير طبيعية.ملاحظة: يتم رفع علم تكاثر الطحالب (الذي يحدد كل بقعة محددة) في مجال الاستشعار عن بعد عندما يتجاوز تركيز Chl-a 20 ملغم/لتر33. 2. أخذ العينات الموجهة ملاحظة: إن اختيار بقع أخذ العينات مدفوع بتحليل طبقة الاستشعار عن بعد/القريب الذي يسمح بتحديد البقع في المناطق الساحلية الكبيرة. ومع مراعاة أن أخذ العينات يمكن أن يشكل خطرا على المشغلين بسبب سمية الميكروستينات، هناك حاجة إلى إجراءات لأخذ عينات السلامة. وعلى وجه الخصوص، هناك حاجة لحماية المشغلين من استنشاق الهباء الجوي والاتصال بالبشرة. ثم قم بإجراء أخذ العينات بعد الإجراء المفصل أدناه. ارتداء نظارات واقية لحماية العين، قناع FFP2 لمنع استنشاق الهباء الجوي، وقفازات السلامة لمنع ملامسة الجلد. جمع 0.5 لتر من المياه في ثلاثة أنواع في كل موقع. قياس الملوحة لكل عينة باستخدام مقياس الانكسار. ضع قطرة من العينة على مقياس الانكسار واقرأ قيمة الملوحة من حيث الأجزاء لكل ألف (ppt – ppt ). في نهاية أخذ العينات، أولا غسل اليدين. ثم بدوره إزالة القفازات، قناع، ونظارات واقية مع الحرص على عدم لمس السطح الخارجي لمعدات الحماية الشخصية. حمل العينة إلى المختبر في درجة حرارة الغرفة. 3. تحديد أنواع البكتيريا الزرقاء من خلال الملاحظات المجهرية وتحديد التصنيف أجهزة الطرد المركزي كل عينة (≈0.5 لتر) في 11200 × ز لمدة 5 دقائق. استخراج supernatants على النحو التالي: صب 500 مل من البوتانول في كل عينة واستخدام قمع، ونقل الخليط لاستخراجها في قمع الفاصلة. ضع القمع الفاصل منتصبا في مشبك الحلقة للسماح لكل من الطبقات بالانفصال. دع المرحلة المائية تستنزف في قارورة إرلينماير. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات. ثم، تركيز المراحل العضوية تحت فراغ ووزنها. جمع الكريات من الخطوة 3.1 وتحليلها في 400x و 1000x التكبير مع المجهر البصري مجهزة كاميرا رقمية 18 MP للمجهر. ابحث عن وجود البكتيريا الزرقاء على أساس ملامحها المورفولوجية: اللون الأزرق والأخضر ، وشكل الخلية ، والحجم تسمح بالتعرف على البكتيريا الزرقاء بين الكائنات الحية الدقيقة الأخرى. تحديد الأنواع من خلال التحليل التصنيفي عن طريق المراقبة المجهرية، وفقا للإجراء الموصوف في كوماريك وآخرون 201434.ملاحظة: يمكن إجراء تحليل تكميلي 16S metagenomic من أجل تحديد تاكسا البكتيريا السيانوبكتيرية3. تمييع aliquot من الكريات مع 10 مل من مياه البحر / المياه العذبة BG11 وسائل الإعلام، وفقا لملوحتها، للزراعة. 4. تحديد سموم السيانوتوسين استخراج العينات مع المذيبات العضوية وضع كل عينة من بيليه في قارورة و sonicate لمدة 5 دقائق باستخدام حمام الجليد. ثم، إضافة 50 مل من MeOH الطازجة ويهز بلطف. تصفية الحل باستخدام مرشح ورقة وجمع filtrate في قارورة أسفل مستديرة. كرر هذه الخطوة مرتين. ثم، استخراج الكريات إضافة خليط 50 مل من MeOH / DCM مرتين (1:1، 50 مل)، ومرتين باستخدام 100٪ DCM (x2، 50 مل)35. تسمية كل قارورة أسفل جولة على التوالي، كما “MeOH استخراج”، “MeOH / DCM استخراج”، و “استخراج DCM”، والتركيز تحت فراغ. تحليل كل استخراج العضوية (MeOH، MeOH / DCM، DCM) بواسطة LC-HRMS/ MS. تحليل LC-HRMS/MS LC-HRMS و LC-HRMS/MS إعداد العينات: حل كل عينة باستخدام MeOH ≥ 99.9٪ للحصول على تركيز نهائي من 10 ملغم / مل. تحليل كل عينة باستخدام مطياف كتلة ESI عالي الدقة مقترنا بنظام HPLC (نظام LC-HRMS/MS). اعمل على HPLC مع عمود C18 5-μm (100 × 2.10 مم)، في درجة حرارة الغرفة. استخدام اللوضوء التدرج مع H2O (تكملها مع 0.1٪ HCOOH) وميوهات 200 ميكرولتر دقيقة-1. برنامج الانحدار هو: 10٪ MeOH لمدة 3 دقائق، 10٪ إلى 100٪ MeOH لمدة 30 دقيقة، 100٪ MeOH لمدة 7 دقائق. الحصول على البيانات. جمع البيانات في وضع الامتلاك المعتمد على البيانات (DDA): يجب أن تخضع الأيونات العشرة الأكثر كثافة في طيف الكتلة المسح الكامل لتحليل الطيف الكتلي الترادفي عالي الدقة (HRMS/MS). الحصول على HRMS/MS بمسح لأيونات محددة مع تجزئة CID، وعرض عزل 2.0، وطاقة تصادم عادية من 35، وتفعيل Q من 0.250، ووقت تنشيط 30 مللي ثانية. التحليلات المعلوماتية الحيوية والشبكات الجزيئية تحليل أنماط التجزئة لكل أيون مكثف باستخدام برامج محددة MS. استخدام كتلة MS الكتلة البيانات (التسامح كتلة الأصل من 1.0 دا و MS/MS تفاوت أيون جزء من 0.5 دا). يتم التخلص من أطياف توافق الآراء التي تحتوي على أقل من 2 أطياف. تحليل بيانات MS/MS بواسطة GNPS (المنتجات الطبيعية العالميةالاجتماعية 36)للربط الشبكي الجزيئي. قارن أطياف توافق الآراء وكذلك مع تلك التي تم الإبلاغ عنها في مكتبات GNPS-Mass-Ive. تصور الشبكة التي تم الحصول عليها37.ملاحظة: للتواصل الجزيئي يرجى الرجوع إلى Sigrist وآخرون 202038. الشكل 3: FDS في المختبر الخطوات (3-4). تمثيل مرئي للأنشطة الرئيسية التي تتم في المختبر بعد أخذ العينات (الخطوتين 3 و4). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Representative Results

في دراسة أولى3، لوحظت أربعة مواقع متأثرة بشريا على طول ساحل كامبانيا في جنوب غرب إيطاليا باستخدام القمر الصناعي لاندسات 8 والطائرات خلال صيف عام 2015. وسمح جهاز استشعار لاندسات 8 التشغيلي لصور الأرض (OLI) وكاميرا الطائرات متعددة الأطياف بإنشاء صور لمؤشر مياه الفرق الطبيعي (NDWI) للمناطق، وبالتالي، للكشف عن وجود مجتمعات بكتيرية سيانوبكتيرية. تم تحديد تكوين المجتمع السيانوبكتيري من خلال التحليلات الطيفية للكشف عن فيكوسيانين الصباغ السيانوبكتيري (PC). ثم، يسمح التحليل التكميلي 16S metagenomic لتحديد تاكسا البكتيريا السيانوبكتيرية. 10- وكانت فهرسة الصور المتعددة الأطياف المبسطة وتصنيفها من خلال منصات ساتلية/جوية مقترنة بالتحاليل الميتاجنومية فعالة في الكشف عن وجود البكتيريا الزرقاء التي تنتمي إلى أجناس مرتبطة بظروف البهيجة القوية (مثل اللبتولنغبيا sp.، Pseudooscillatoria sp.) في مرحلة مبكرة من الإزهار. في دراسة ثانية14، تم اختبار نهج FDS خلال ربيع وصيف 2017. واستخدمت البيانات الساتلية كمستوى الاستشعار عن بعد الوحيد. بالتفصيل، سمحت البيانات التي حصل عليها مستشعر مطياف الصور MODerate (MODIS)، المثبت على منصات الأقمار الصناعية Terra و Aqua، بتقدير كمي للكلوروفل-أ (Chl-a) في المسطحات المائية على طول سواحل كامبانيا وقادت اختيار عشرة بقع لأخذ العينات. وقد عولجت العينات في المختبر عن طريق المراقبة المجهرية وتحديد التصنيف، ثم استخرجت بمذيبات عضوية. تمت معالجة المستخلصات العضوية من خلال تحليل LC-MS-MS. تم تحليل البيانات التي تم الحصول عليها من قبل MS-MS باستخدام نهج المعلوماتية الحيوية، وذلك باستخدام منصة GNPS لإنشاء شبكة من الجزيئات. وتم تحليل الشبكة للكشف عن السموم وتحديدها مقارنة بيانات أطياف التجزئة التي تم الحصول عليها عن طريق قياس الطيف الكتلي مع مكتبة الناتج القومي الإجمالي. هذا سمح للكشف عن السموم المعروفة ونظائرها غير معروف التي سوف تظهر ذات الصلة في نفس الشبكة الجزيئية. وعلى وجه التحديد، تم الكشف عن لينغبياتوشين A، وهو سموم جلدية للدهون، في جميع عينات المياه وعينات ثنائية الصمامات؛ في مجموعة Lyngbyatoxin الجزيئية A ، كانت العقد غير المرتبطة بأي مركبات معروفة من عائلة lyngbyatoxins موجودة أيضا ، مما يشير إلى وجود نظائر lyngbyatoxin غير معروفة. ولم تكتشف أي ميكروسيتينات وغيرها من السموم في العينات. تم الحصول على جميع النتائج في غضون 24 ساعة عمل. الشكل 4: نتائج ممثل FDS. مثال على تطبيق استراتيجية FDS على ساحل كامبانيا (إيطاليا). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

خلال السنوات الماضية، قام فريقنا باختبار العديد من النهج المختلفة التي سمحت بكشف وجود البكتيريا الزرقاء والسموم السيانوتوسينية في المسطحات المائية والصمامات الثنائية. وتمثل الاستراتيجية الجديدة المطورة نتيجة لهذه الدراسات. يتم جمع التقنيات والتقنيات المثلى التي تناسب نطاق الكشف السريع ، تحت قبعة إجراء فريد من نوعه يزيد من فعالية كل خطوة. المنطقة المستهدفة، وتمديد إزهار، ومرحلة النمو هي القوة الدافعة لاختيار الأساليب والتكنولوجيات المناسبة لاستخدامها.

وعندما تكون الأولوية هي الكشف السريع للبكتيريا الزرقاء والسيانوتوكسيينات، يتم تبسيط الاستراتيجية لتخفيض العدد الإجمالي إلى أربع خطوات رئيسية: (1) الاستشعار عن بعد وبروكسيل وتحليل البيانات لإجراء مسح أول، وتوطين المواقع وتعريف نمط الإزهار وتمديده؛ (2) الاستشعار عن بعد وتحليل البيانات عن طريق الأجهزة؛ (2) التحسس عن بعد وتحليل البيانات عن طريق الأجهزة التي يمكن أن تكون بعيدة عن نطاقها؛ (2) التحسس عن بعد والسموم الزرقاء؛ (3) التحسس عن بعد وتحليل البيانات عن طريق المسح الأول، وتوطين المواقع، وتحديد نمط الإزهار والتمداد؛ (2) التحسس عن بعد أو عن بعد وتحليل البيانات في أول دراسة استقصائية، وتوطين المواقع، وتحديد نمط الإزهار والامتداد؛ (2) التحسس عن بعد والسموم الزرقاء؛ (2) التحسس السريع للسمرة الزرقاء؛ ( (2) أخذ العينات الموجهة؛ (3) المراقبة المجهرية والتحليل التصنيفي؛ (4) التحليل الكيميائي والربط الشبكي الجزيئي لبيانات مرض التصلب العصبي المتعدد LC-MS من أجل إزالة التشبيك لعينات المياه والكشف السريع عن السموم السيانوتوسينية.

وفيما يتعلق بالخطوة الأولى، حتى لو كان توافر البيانات التي حصلت عليها سلسلة كاملة من المنصات التي تغطي جميع طبقات نهج الرصد الهرمي هو الحل الأفضل لإعادة تكوين رؤية كاملة للسيناريو الذي تم تحليله، فإن طبقة معلومات واحدة فقط يمكن أن تدفع إجراءات مسح المنطقة وتركز بفعالية على النقاط الساخنة لتنفيذ إجراءات أخذ العينات في الموقع. ووفقا للتجارب المبلغ عنها التي تم فيها الحصول على البيانات باستخدام السواتل والطائرات والطائرات العمودية والطائرات بدون طيار، فإن الحل الذي يطابق تماما الاحتياجات التي تتطلبها استراتيجية الكشف السريع هو استخدام المنتجات الساتلية الوحيدة.

وبالإضافة إلى ذلك، فإن طبقات المعلومات المستمدة من البعثات التي تقوم بها منصات تحلق على ارتفاعات أقل من السواتل (مثل الطائرات والمروحيات والطائرات بدون طيار) تقتفي المعلومات بدقة كبيرة ولكنها مكلفة للغاية وتتطلب أيضا مزيدا من الوقت لإكمال عملية الاقتناء الكاملة التي تشمل أيضا تحديد خطة الطيران والموافقة عليها.

وبمجرد اختيار البقع التي ستكون عينات (الخطوة 2)، فإن التحليلات التحليلية/المعلوماتية الحيوية (الشبكات الجزيئية لبيانات LC-MS) هي أداة لتحلل عينات المياه بسرعة والكشف السريع عن سموم السيانوتوكين (الخطوتين 3 و4). 16S تحليل الميتاجنوميك يستغرق ما لا يقل عن 2 أسابيع من العمل. وعلاوة على ذلك، حتى عندما يتم تحديد الأنواع البكتيرية السيانوبكتيرية السامة بشكل عام، لا يتم إثبات إنتاجها من السموم. لنفس السبب، المراقبة المجهرية ليست في حد ذاتها كافية للكشف عن وجود البكتيريا الزرقاء السامة. وبطبيعة الحال، فإن تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد والشبكات الجزيئية لها بعض القيود؛ فهي فعالة جدا إذا كانت مركبات الفائدة (مثل السموم) تأين جيدا في الظروف المطبقة، إذا كانت في كمية كافية ليتم الكشف عنها. لغرض الكشف عن السموم السيانوبكتيرية المعروفة والرصد ، والشبكات الجزيئية القائمة على مرض التصلب العصبي المتعدد يمثل في الواقع واحدة من أكثر التقنيات قوة وموثوقية.

ولذلك، فإن هذا النهج يثبت أنه مفيد جدا عندما تكون هناك حاجة إلى الكشف السريع عن البكتيريا الزرقاء والسموم الزرقاء ذات الصلة؛ وعلاوة على ذلك، فإن التحديد الكمي لكل من الإزهار والتكسين البكتيري السيانوبكتيري على مر الزمان والمكان ممكن أيضا من خلال هذه الاستراتيجية لمنع مشاكل المجتمعات الصحية التي يمكن أن تنشأ عن الأزهار السامة البكتيرية السيانوبكتيرية الكبيرة.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم تمويل هذا البحث من قبل “سنترو دي رايفريمنتو الإقليمية لكل لا Sicurezza سانيتاريا ديل بيسكاتو (CRiSSaP)” في إطار مشروع “Attività pilota di Monitoraggio di Cianobatteri نيلا fascia costiera della regione Campania”، وأدى بالتعاون مع وكالة حماية البيئة في منطقة كامبانيا، إيطاليا (ARPAC)، “Istituto Zooprofilattico سبيريمنتوال ديل ميزوجيورنو/أوسيرفاتوريو الإقليمية في لا سيكوريزا أليمنتاري” (IZSM/ORSA)، جامعة نابولي “فيديريكو الثاني” – قسم الطب البيطري والإنتاج الحيواني، المرجع البروفيسور أ. أناستاسيو).

Materials

10X Vitamin mix			Nicotinic acid 100 mg/100 mL; PABA 10 mg/100 mL; Biotin 1 mg/100 mL; Thiamine 200 mg/100 mL; B₁₂ 1 mg/100 mL; Folic Acid 1 mg/100 mL; i-inositol 1 mg/100 mL; Ca-pantothenate 100 mg/100 mL
1-BuOH	Sigma-Aldrich	33065.2.5L-R
BG11 stock solution			Na₂EDTA 20 mg/L; Ferric ammonium citrate 120 mg/L; Citric acid·1H₂O 120 mg/L; CaCl₂·2H₂O 700 mg/L, MgSO₄·7H₂O 1.5 g/L, K₂HPO₄·3H₂O 800 mg/L, NiSO₄(NH₄)2SO₄·6H₂O (0.1 mM stock) 5 mL; Na₂SeO₄ (0.1 mM stock) 2 mL, Nitsch's Solution 20 mL
Centrifuge	Hermle	Z36HK
CHCl₃	Honeywell	32211.2.5L
H₂O	Sigma-Aldrich	34877.2.5L
Kinetex C18 cloumn	Phenomenex
LTQ Orbitrap XL high-resolution ESI mass spectrometer coupled to a U3000 HPLC system	Thermo
MeOH	Honeywell	32213.2.5L
Microscope equipped with an OMAX 18 MP CMOS camera	Optech	Biostar B3
Multiband camera	Intergraph DMC
Nitsch's Solution			H₃BO₃0.5 g/L MnSO₄· H₂O 2.28 g/L ZnSO₄·7H₂O 0.5 g/L CuSO₄·5H₂O 0.025 g/L COCl₂·6H₂O 0.135 g/L Na₂MoO₄·2H₂O 0.025 g/L
Refractomer mr 100 ATC	AQL
SWBG11 medium			BG11 stock solution 50 mL/L; Instant Ocean 33 g/L; Water 950 mL/L 10X; Vitamin mix 100 µL/L

References

Tamele, I. J., Silva, M., Vasconcelos, V. The incidence of marine toxins and the associated seafood poisoning episodes in the African countries of the Indian ocean and the Red sea. Toxins. 11 (1), 25-48 (2019).
Lürling, M., Faassen, E. J. Dog poisonings associated with a Microcystis aeruginosa bloom in the Netherlands. Toxins. 5 (3), 556-567 (2013).
O’Neil, J. M., Davis, T. W., Burford, M. A., Gobler, C. J. The rise of harmful cyanobacteria blooms: The potential roles of eutrophication and climate change. Harmful Algae. 14, 313-334 (2012).
Teta, R., et al. Cyanobacteria as indicators of water quality in Campania coasts, Italy: A monitoring strategy combining remote/proximal sensing and in situ data. Environmental Research Letters. 12 (2), (2017).
Teta, R. Bioindicators as a tool in environmental impact assessment: Cyanobacteria as a sentinel of pollution. International Journal of Sustainable Development and Planning. 14 (1), 1-8 (2019).
Teta, R., Della Sala, G., Mangoni, A., Lega, M., Costantino, V. Tracing cyanobacterial blooms to assess the impact of wastewaters discharges on coastal areas and lakes. International Journal of Sustainable Development and Planning. 11 (5), 804-811 (2016).
Teta, R., et al. A joint molecular networking study of a: Smenospongia sponge and a cyanobacterial bloom revealed new antiproliferative chlorinated polyketides. Organic Chemistry Frontiers. 6 (11), 1762-1774 (2019).
Singh, R. K., Tiwari, S. P., Rai, A. K., Mohapatra, T. M. Cyanobacteria: an emerging source for drug discovery. Journal of Antibiotics. 64 (6), 401-412 (2011).
Huisman, J., et al. Cyanobacterial blooms. Nature Reviews Microbiology. 16 (8), 471-483 (2018).
Gupta, N., Pant, S. C., Vijayaraghavan, R., Rao, P. V. L. Comparative toxicity evaluation of cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin variants (LR, RR, YR) in mice. Toxicology. 188 (2-3), 285-296 (2003).
WHO. Cyanobacterial toxins: Microcystin-LR in drinking water. Background document for development of WHO Guidelines for Drinking-Water Quality. WHO. 2, (1998).
Agha, R., Cirés, S., Wörmer, L., Domínguez, J. A., Quesada, A. Multi-scale strategies for the monitoring of freshwater cyanobacteria: Reducing the sources of uncertainty. Water Research. 46 (9), 3043-3053 (2012).
Giménez-Campillo, C. Determination of cyanotoxins and phycotoxins in seawater and algae-based food supplements using ionic liquids and liquid chromatography with time-of-flight mass spectrometry. Toxins. 11 (10), 610 (2019).
Sanseverino, I., António, D. C., Loos, R., Lettieri, T. Cyanotoxins: methods and approaches for their analysis and detection. JRC Technical Reports. , (2017).
Teta, R. Combined LC-MS/MS and molecular networking approach reveals new cyanotoxins from the 2014 cyanobacterial bloom in Green Lake, Seattle. Environmental Science and Technology. 49 (24), 14301-14310 (2015).
Esposito, G., et al. A fast detection strategy for cyanobacterial blooms and associated cyanotoxins (FDSCC) reveals the occurrence of lyngbyatoxin A in campania (South Italy). Chemosphere. 225, 342-351 (2019).
Lega, M., Casazza, M., Teta, R., Zappa, C. J. Environmental impact assessment: a multilevel, multi-parametric framework for coastal waters. International Journal of Sustainable Development and Planning. 13 (8), 1041-1049 (2018).
Di Fiore, V. Integrated hierarchical geo-environmental survey strategy applied to the detection and investigation of an illegal landfill: A case study in the Campania Region (Southern Italy). Forensic Science International. 279, 96-105 (2017).
Gargiulo, F., Persechino, G., Lega, M., Errico, A. IDES project: A new effective tool for safety and security in the environment. Lecture Notes in Computer Science (including subseries Lecture Notes in Artificial Intelligence and Lecture Notes in Bioinformatics). , (2013).
Ferrara, C., Lega, M., Fusco, G., Bishop, P., Endreny, T. Characterization of terrestrial discharges into coastal waters with thermal imagery from a hierarchical monitoring program. Water. 9 (7), (2017).
Alfeo, A. L., Cimino, M. G. C. A., De Francesco, N., Lega, M., Vaglini, G. Design and simulation of the emergent behavior of small drones swarming for distributed target localization. Journal of Computational Science. 29, 19-33 (2018).
Casazza, M., Lega, M., Liu, G., Ulgiati, S., Endreny, T. A. Aerosol pollution, including eroded soils, intensifies cloud growth, precipitation, and soil erosion: a review. Journal of Cleaner Production. 189, 135-144 (2018).
. U.S. Geological Survey Available from: https://ers.cr.usgs.gov (2020)
. NASA Earthdata Available from: https://urs.earthdata.nasa.gov (2020)
. Copernicus Opern Access Hub Available from: https://scihub.copernicus.eu/apihub (2020)
Chen, H. -. H., Tang, R., Zhang, H. -. R., Yu, Y., Wang, Y. Investigating the relationship between sea surface chlorophyll and major features of the south china sea with satellite information. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), (2020).
. QGIS Available from: https://www.qgis.org/it/site/ (2020)
. Semi-automatic classification plugin documentation release 4.8.0.1 Available from: https://manualzz.com/doc/7130012/semi-automatic-classification-plugin-documentation (2016)
Rouse, J. W., Hass, R. H., Schell, J. A., Deering, D. W. Monitoring vegetation systems in the great plains with ERTS. Third Earth Resources Technology Satellite (ERTS) Symposium. 1, 309-317 (1973).
Carmona, F., Rivas, R., Fonnegra, D. C. Vegetation index to estimate chlorophyll content from multispectral remote sensing data. European Journal of Remote Sensing. 48 (1), 319-326 (2015).
Savtchenko, A., et al. MODIS data from terra and aqua satellites. International Geoscience and Remote Sensing Symposium (IGARSS). 5, 3028-3030 (2003).
Binding, C. E., Greenberg, T. A., McCullough, G., Watson, S. B., Page, E. An analysis of satellite-derived chlorophyll and algal bloom indices on Lake Winnipeg. Journal of Great Lakes Research. 44 (3), 436-446 (2018).
Komárek, J., Kaštovský, J., Mareš, J., Johansen, J. R. Taxonomic classification of cyanoprokaryotes (cyanobacterial genera) 2014, using a polyphasic approach. Preslia. 86, 295-335 (2014).
Esposito, G., et al. Chlorinated thiazole-containing polyketide-peptides from the caribbean sponge smenospongia conulosa: structure elucidation on microgram scale. European Journal of Organic Chemistry. 2016 (16), 2871-2875 (2016).
Shannon, P. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Research. 13 (11), 2498-2504 (2003).
Sigrist, R., Paulo, B. S., Angolini, C. F. F., De Oliveira, L. G. Mass spectrometry-guided genome mining as a tool to uncover novel natural products. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Teta, R., Esposito, G., De Sterlich, C., Lega, M., Costantino, V. Early Detection of Cyanobacterial Blooms and Associated Cyanotoxins using Fast Detection Strategy. J. Vis. Exp. (168), e61889, doi:10.3791/61889 (2021).

Automatically Generated