Early Detection of Cyanobacterial Blooms and Associated Cyanotoxins using Fast Detection Strategy

Roberta Teta; Germana Esposito; Carlo De Sterlich; Massimiliano Lega; Valeria Costantino

doi:10.3791/61889

JoVE Journal > Chemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Chemistry

Раннее обнаружение цветения цианобактерий и связанных с ними цианотоксинов с использованием стратегии быстрого обнаружения

Published: February 25, 2021

doi:

10.3791/61889

Roberta Teta¹, Germana Esposito¹, Carlo De Sterlich², Massimiliano Lega*³, Valeria Costantino*¹

¹TheBlueChemistryLab, Department of Pharmacy,University of Naples Federico II, ²Department of Public Health,University of Naples Federico II, ³Department of Engineering,University Parthenope

Summary

Здесь описана быстро-мультидисциплинарнаястратегия для раннего выявления цветения цианобактерий и связанных с ними цианотоксинов. Он позволяет обнаруживать цианобактерии и связанные с ними цианотоксины в пробах воды и в органических матрицах, таких как образцы двустворчатых моллюсков, за 24 ч.

Abstract

Быстрое обнаружение цианобактерий и цианотоксинов достигается с помощью стратегии быстрого обнаружения (FDS). Всего 24 ч необходимо, чтобы разгадать присутствие цианобактерий и связанных с ними цианотоксинов в образцах воды и в органической матрице, такой как экстракты двустворчатых моллюсков. FDS сочетает в себе методы дистанционного/проксимального зондирования с аналитическим/биоинформатическим анализом. Места отбора проб выбираются с помощью многодисциплинарного, многомасштабного и многопараметрического мониторинга в трехмерном физическом пространстве, включая дистанционное зондирование. Микроскопическое наблюдение и таксономический анализ образцов выполняются в лабораторных условиях, что позволяет идентифицировать виды цианобактерий. Затем образцы экстрагируют органическими растворителями и обрабатывают LC-MS/MS. Данные, полученные MS/MS, анализируются с использованием биоинформатического подхода с использованием онлайн-платформы Global Natural Products Social (GNPS) для создания сети молекул. Эти сети анализируются для обнаружения и идентификации токсинов, сравнивая данные спектров фрагментации, полученные масс-спектрометрией, с библиотекой GNPS. Это позволяет обнаруживать известные токсины и неизвестные аналоги, которые появляются связанными в одной молекулярной сети.

Introduction

Цветение цианобактерий стало экологической проблемой во всем мире за последние 15 лет^1,^2. Цветение цианобактерий обусловлено чрезмерным разрастанием микроорганизмов, называемых цианобактериями. Они представляют собой заметную группу фотосинтетических микроорганизмов, которые приспособились жить в большом массиве сред, включая тропические районы и чрезвычайно холодные воды. Они известны тем, что производят большие цветы, покрывающие водные поверхности, особенно в ответ на массовое обогащение питательными веществами, так называемый процесс эвтрофикации^3.

Поэтому цианобактерии являются отличными биоиндикаторами загрязнения^{вод 4,}^5,^6. Они также могут производить широкий спектр природных соединений с интересными фармакологическими^{свойствами}^7,^8. Экологической проблемой, связанной с цианобактериями, являются сами цветения. Цветение может блокировать солнечный свет для подводных трав, потреблять кислород в воде, что приводит к убийству рыбы, производить поверхностные накипи и запахи и мешать фильтрованной подаче организмов^9.

Кроме того, и даже более серьезно, при определенной комбинации таких факторов, как температура, питательные вещества (фосфор и азот), солнечный свет (для фотосинтеза) и рН воды, цветение цианобактерий вызывает выработку токсинов; поэтому они становятся вредными для человека и животных. Наиболее изученный класс цианотоксинов продуцируется родами Microcystis. Это циклические пептиды, известные под общим названием микроцистины (МК): микроцистин-LR является наиболее изученным как способный продуцировать тяжелую гепатоксичность^10. Животные и люди могут подвергаться воздействию МК при проглатывании загрязненной питьевой воды или пищи. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) предложила общее значение микроцистина-LR 0,001 мг/л в качестве руководящего принципа^11. Однако это связано только с одним вариантом (т.е. MC-LR) из более чем 100 микроцистинов, которые были выделены до сих пор.

Комбинированные методы, о которых сообщалось ранее, такие как дистанционное зондирование с анализом MALDI-TOF MS^12,^{13, 14,}^15,были сосредоточены на обнаружении концентраций МС. Самые последние методы используют датчики низкого разрешения, которые эффективны при обнаружении только широких блумовых просторов; они также способны выявлять только токсины, для которых имеются стандарты. Более того, большинство из этих процедур отнимают много времени, и время является драматическим фактором для раннего обнаружения цветения, чтобы предотвратить или свести к минимуму проблемы безопасности. Предложенная здесь мультидисциплинарная стратегия обеспечивает быстрое обнаружение цветения цианобактерий и цианотоксинов уже через 24 ч^16.

В рамках программы под названием MuM3 «Многодисциплинарный, многомасштабный и многопараметрический мониторинг в трехмерном (3D) физическом пространстве»^17,^18,Стратегия быстрого обнаружения (FDS) сочетает в себе преимущества нескольких методов: 1) дистанционного зондирования для обнаружения цветка; 2) микроскопическое наблюдение для выявления видов цианобактерий; и 3) аналитические/биоинформатические анализы, а именно молекулярные сети на основе LC-HRMS, для выявления цианотоксинов. Результаты получаются в течение 24 ч.

Новый подход полезен для мониторинга широких прибрежных районов в течение короткого времени, избегая многочисленных проб и анализов и сокращая время и затраты на обнаружение. Данная стратегия является результатом изучения и применения различных подходов к мониторингу цианобактерий и их токсинов и сочетает в себе преимущества каждого из них. В частности, анализ результатов, полученных в результате использования различных платформ (спутник, летательные аппараты, беспилотные летательные аппараты) и датчиков (MODIS, тепловой инфракрасный) для анализа дистанционного зондирования, таких как различные методологические подходы к идентификации цианобактериальных видов (микроскоп, спектроскопия UV-Vis, анализ 16S) и токсинов (анализ LC-MS, молекулярные сети), позволил выбрать наиболее подходящий метод как для конкретных, так и для общих целей. Новая методология была опробована и апробирована в последующих мониторинговых кампаниях на побережьях Кампании (Италия) в рамках программы мониторинга агентства по охране окружающей среды Кампании.

Рисунок 1:Стратегия FDS. Обзор стратегии быстрого обнаружения цианобактерий и цианотоксинов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Protocol

1. Дистанционное и проксимальное зондирование: сбор и анализ данных ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае данные дистанционного/проксимального зондирования используются для первого обследования макропроиспуска и для отбора конкретных участков прибрежных районов, которые будут отобраны. В схеме17 фреймворка MuM3 логический поток основан на иерархической модели мониторинга, включающей несколько уровней, называемых информационными слоями. Информация каждого уровня основана на данных, полученных с помощью одного или нескольких датчиков, перевозимых на борту платформ, расположенных на разных высотах. Каждый уровень определяет пространственный масштаб в зависимости от высоты измерения19. Существует потенциал для нескольких датчиков на каждом уровне. Вот некоторые примеры: видимая в ближнем инфракрасном диапазоне (VNIR) и тепловизионная инфракрасная (TIR) съемка20 на спутниках, самолетах, вертолетах, БПЛА21 и на поверхности; физические, химические и биологические анализы и т.д.22 на поверхности и в быстром ответе с использованием мобильной лаборатории. Данные, полученные каждым датчиком, обрабатываются и объединяются для расчета мультиспектральных индексов (например, нормализованный разностный вегетационный индекс (NDVI), нормализованный разностный водный индекс (NDWI), индекс хлорофилла и т. Д.), Поэтому необработанные данные преобразуются в более полезные параметры и форматы (например, тематическая карта). Рисунок 2:Анализ дистанционного/проксимального зондирования для отбора проб (этапы 1-2). Многоуровневый и мультисенсорный подход для обнаружения цветения цианобактерий. Сбор данных осуществляется спутником(A),самолетом(B)и/или дроном(C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Получение данных дистанционного и проксимального зондирования Извлечение данных из различных общедоступных и частных наборов данных дистанционного зондирования, подготовленных специально для поиска контента и классификации сцен. Типичные источники набора данных, используемые на этом этапе, включают: продукты Landsat, предоставленные Геологической службой США23,продукты Sentinel-2,3, предоставленные NASA24,и Copernicus Open Access Hub25,MODIS-Aqua26. Определите продукты, доступные для конкретной области, диапазона дат и рассмотрите предел, полученный облачным покровом. Определите: А) интересуемую область с помощью графического пользовательского интерфейса и выбора полигонов; Б) диапазон дат и облачное покрытие с использованием полей фильтра текстовых запросов.ПРИМЕЧАНИЕ: Даже если во многих научных отчетах говорится, что приемлемое значение облачного покрова составляет <20%, в этом типе исследований важно обращать внимание на реальный облачный покров только на поверхности воды, поэтому значение эффективности для этого региона составляет <5%. Выбирайте продукты, полученные с платформ, наилучшим образом соответствующих конкретным потребностям миссии. Из каждой комбинации технических характеристик спутника и полезной нагрузки можно получить несколько коллекций продукции. Например, продукты данных NASA EOSDIS24 обрабатываются на различных уровнях от уровня 0 до уровня 4: продукты уровня 0 представляют собой необработанные данные с полным разрешением прибора, в то время как на более высоких уровнях данные преобразуются в более полезные параметры и форматы. Обычно доступны уровни 0-1, в то время как продукты на уровнях 2-4 нуждаются в специальной обработке, связанной с конкретными исследовательскими целями, поэтому их доступность ограничена во времени и охвачен регионом. Скачать выбранный набор данных спутниковых наблюдений. В деталях, выбирая среди списка результатов предыдущего действия, загрузите полный набор данных продукта (например, группу файлов geo-tiff, по одному для каждой полосы, плюс информацию и другие метаданные) или только определенную одну полосу.ПРИМЕЧАНИЕ: Для конкретного описания каждого основного действия, включенного в процедуру шага 1, пожалуйста, также обратитесь к Huan-Huan Chen et al. 202027. Предварительная обработка и обработка данных для анализа и преобразования в более полезные параметры и форматы, позволяющие провести первый скрининг макрообласти.ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие действия (шаг 1.2) посвящены обработке данных, завершенной для преобразования необработанных данных, поступающих с более низких уровней, в информацию, а затем в полезную информацию (более высокие уровни). Этот этап состоит из обработки исходных данных с каждого датчика (например, уровни продукта 0-1) и преобразования в продукты более высокого уровня (например, уровни 2-4) и, следовательно, в информационные слои для генерации более полезных параметров и форматов (например, тематическая карта). Предварительная обработка необработанных данных с использованием геометрической и радиометрической калибровки. Это действие может быть выполнено с использованием специального программного обеспечения, которое автоматическим или полуавтоматическим способом (без присмотра или под наблюдением) предоставляет набор подключенных инструментов для обработки растров, чтобы выполнить простую классификацию в отношении правильного рабочего процесса.ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании используются два бесплатных инструмента с открытым исходным кодом: Q-GIS 3.1428 в сочетании с полуавтоматическим плагином классификации (SCP). ПлагинSCP 29 позволяет полуавтоматическая классификация изображений дистанционного зондирования, предоставляя полный набор инструментов для загрузки бесплатных изображений, предварительной обработки, постобработки и растрового расчета. Обработка калиброванных данных, вычисляя мультиспектральные индексы. Как правило, это действие выполняется с помощью инструмента растрового калькулятора. Расчет мультиспектрального индекса определяет корреляцию между различными полосами/слоями, которая в результате генерирует новый слой, которым можно управлять на ГИС-платформе. Например, начиная с датчика оперативного наземного томоибра Sentinel и Landsat (OLI), можно рассчитать мультиспектральные индексы, такие какNormalized Difference Vegetation Index (NDVI). Затем вегетационный индекс используется для оценки содержания хлорофилла30,31. Проанализировать результаты, полученные в результате оценки индекса содержания хлорофилла, представленного как в ложных цветных тематических картах, и определить критическую область с высокой концентрацией хлорофилла. В этом исследовании хлорофилл-карта генерируется с использованием набора данных датчика MODIS32,установленного на спутниковых платформах Terra и Aqua. Места отбора проб локализуются там, где регистрируются аномальные значения.ПРИМЕЧАНИЕ: Флаг цветения водорослей (который определяет каждое конкретное пятно) поднимается в области дистанционного зондирования, когда концентрация Chl-a превышает 20 мг/л33. 2. Управляемые выборки ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор мест отбора проб обусловлен анализом слоев дистанционного/проксимального зондирования, который позволяет выбирать места в больших прибрежных районах. Принимая во внимание, что отбор проб может быть опасным для операторов из-за токсичности микроцистинов, необходимы безопасные процедуры отбора проб. В частности, это необходимо для защиты операторов от вдыхания аэрозолей и контакта с кожей. Затем выполните выборку, следуя процедуре, описанной ниже. Носите защитные очки для защиты глаз, маску FFP2 для предотвращения вдыхания аэрозоля и защитные перчатки для предотвращения контакта с кожей. Соберите 0,5 л воды в трех количествах на каждом участке. Измерьте соленость для каждого образца с помощью рефрактометра. Положите каплю образца на рефрактометр и считайте значение солености в пересчете на части на тысячу (ppt – ‰). В конце отбора проб сначала вымойте руки; затем, в свою очередь, снимите перчатки, маску и очки, заботясь о том, чтобы не коснуться внешней поверхности средств индивидуальной защиты. Перенесем образец в лабораторию при комнатной температуре. 3. Идентификация видов цианобактерий путем микроскопических наблюдений и таксономической идентификации Центрифуга каждого образца (≈0,5 л) при 11 200 х г в течение 5 мин. Экстрагировать супернатанты следующим образом: заливают 500 мл бутанола в каждый образец и, используя воронку, переносят смесь, которую нужно экстрагировать, в сепараторную воронку. Поместите сепарационную воронку вертикально в кольцевой зажим, чтобы оба слоя могли разделиться. Дайте водной фазе стечь в колбу Эрленмейера. Повторите этот шаг три раза. Затем сконцентрируйте органические фазы в вакууме и взвесьте их. Соберите гранулы с шага 3.1 и проанализируйте их с увеличением 400x и 1000x с помощью оптического микроскопа, оснащенного 18-мегапиксельной цифровой камерой для микроскопа. Искать наличие цианобактерий можно на основании их морфологических особенностей: сине-зеленый цвет, форма клеток и размер позволяют распознавать цианобактерии среди других микроорганизмов. Идентификация вида с помощью таксономического анализа путем микроскопического наблюдения, в соответствии с процедурой, описанной в Komarék et al. 201434.ПРИМЕЧАНИЕ: Комплементарный метагеномный анализ 16S может быть выполнен с целью идентификации таксонов цианобактерий3. Разбавьте аликвоту гранул 10 мл морской воды/пресноводной среды BG11 в соответствии с ее соленостью для выращивания. 4. Идентификация цианотоксинов Экстракция образцов органическими растворителями Поместите каждый образец гранулы в колбу и обложите ультразвуком в течение 5 минут с помощью ледяной ванны. Затем добавьте 50 мл свежего MeOH и аккуратно встряхните. Процедить раствор с помощью бумажного фильтра и собрать фильтрат в колбу с круглым дном. Повторите этот шаг дважды. Затем экстрагируют гранулы, добавляя 50 мл смеси MeOH/DCM дважды (1:1, 50 мл) и дважды используя 100% DCM (x2, 50 мл)35. Маркируйте каждую колбу с круглым дном соответственно как «Экстракт MeOH», «Экстракт MeOH / DCM» и «Экстракт DCM» и концентрат в вакууме. Анализируйте каждый органический экстракт (MeOH, MeOH/DCM, DCM) с помощью LC-HRMS/MS. Анализ LC-HRMS/MS Подготовка образцов LC-HRMS и LC-HRMS/MS: растворите каждый образец с использованием MeOH ≥ 99,9% для получения конечной концентрации 10 мг/мл. Анализируйте каждый образец с помощью масс-спектрометра ESI высокого разрешения в сочетании с системой ВЭЖХ (система LC-HRMS/MS). Работа на ВЭЖХ с 5-мкм колонкой C18 (100 х 2,10 мм), при комнатной температуре. Используют градиентное элюирование сH2O(дополненное 0,1% HCOOH) и MeOHat 200 мклмин-1. Градиентная программа: 10% MeOH в течение 3 мин, от 10% до 100% MeOH в течение 30 мин, 100% MeOH в течение 7 мин. Используйте MeOH в качестве контроля. сбор данных. Сбор данных в режиме сбора данных (DDA): 10 наиболее интенсивных ионов масс-спектра полного сканирования должны быть подвергнуты анализу тандемной масс-спектрометрии высокого разрешения (HRMS/MS). Получение сканирования HRMS/MS для выбранных ионов с фрагментацией CID, шириной изоляции 2,0, нормированной энергией столкновения 35, активацией Q 0,250 и временем активации 30 мс. Биоинформатический анализ и молекулярные сети Анализируйте паттерны фрагментации для каждого интенсивного иона с помощью специального программного обеспечения MS. Используйте MS-Cluster для кластеризации данных (допуск родительской массы 1,0 Da и допуск ионов фрагментов MS/MS 0,5 Da). Консенсусные спектры, содержащие менее 2 спектров, исключаются. Анализ данных MS/MS с помощью GNPS (Global Natural Products Social36)для молекулярных сетей. Попарно сравнивайте консенсусные спектры, а также с теми, о которых сообщается в библиотеках GNPS-Mass-Ive. Визуализируйте полученную сеть37.ПРИМЕЧАНИЕ: Для молекулярных сетей, пожалуйста, обратитесь к Sigrist et al. 202038. Рисунок 3:Лабораторные этапы FDS (3-4). Визуальное представление основных видов деятельности, выполняемых в лаборатории после отбора проб (этапы 3 и 4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Representative Results

В первом исследовании3четыре антропогенно затронутых участка вдоль побережья Кампании на западе Италии были замечены с использованием спутника Landsat 8 и самолетов летом 2015 года. Оперативный наземный датчик Landsat 8 (OLI) и мультиспектральная камера самолета позволили создать нормализованные разностные водные индексы (NDWI) изображения для районов, следовательно, выявить наличие цианобактериальных сообществ. Состав цианобактериального сообщества определяли с помощью спектрофотометрических анализов для обнаружения цианобактериального пигмента фикоцианина (ПК). Затем комплементарный метагеномный анализ 16S позволил выявить таксоны цианобактерий. Упрощенная мультиспектральная индексировка и классификация изображений с помощью спутниковых/воздушных платформ в сочетании с метагеномным анализом оказались эффективными в обнаружении присутствия цианобактерий, принадлежащих к родам, связанным с сильными эвтрофными условиями (такими как Leptolyngbya sp., Pseudooscillatoria sp.), на ранней стадии цветения. Во втором исследовании14подход FDS был протестирован в течение весны / лета 2017 года. Спутниковые данные использовались в качестве единственного уровня дистанционного зондирования. В деталях данные, полученные датчиком MODerate Image Spectroradiometer (MODIS), установленным на спутниковых платформах Terra и Aqua, позволили количественно оценить хлорофилл-а (Chl-a) в водоемах вдоль побережья Кампании и определили выбор из десяти мест отбора проб. Образцы обрабатывали в лаборатории путем микроскопического наблюдения и таксономической идентификации, а затем экстрагировали органическими растворителями. Органические экстракты обрабатывались методом анализа LC-MS-MS. Данные, полученные MS-MS, были проанализированы с использованием биоинформатического подхода, с использованием платформы GNPS для создания сети молекул. Сеть была проанализирована для обнаружения и идентификации токсинов, сравнивая данные спектров фрагментации, полученные масс-спектрометрией, с библиотекой GNPS. Это позволило обнаружить известные токсины и неизвестные аналоги, которые появятся связанными в одной молекулярной сети. В частности, Лингбьятоксин А, липофильный дерматотоксин, был обнаружен во всех пробах воды и двустворчатых моллюсков; в молекулярном кластере Лингбятоксина А также присутствовали узлы, не связанные с какими-либо известными соединениями семейства лингбятоксинов, что свидетельствует о наличии неизвестных аналогов лингбятоксина. В образцах не было обнаружено микроцистинов и других токсинов. Все результаты были получены в течение 24 человеко-часов. Рисунок 4:Репрезентативные результаты FDS. Пример применения стратегии FDS на побережье Кампании (Италия). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

В течение последних лет наша команда протестировала и проверила несколько различных подходов, которые позволили разгадать присутствие цианобактерий и цианотоксинов в водоемах и двустворчатых моллюсках. Новая разработанная стратегия представляет собой результат этих исследований. Оптимальные приемы и технологии, которые подходят под сферу быстрого обнаружения, собраны под шляпой уникальной процедуры, которая максимизирует эффективность каждого отдельного шага. Целевая область, расширение цветения и стадия роста являются движущей силой для выбора подходящих методов и технологий для использования.

Когда приоритетной задачей является быстрое обнаружение цианобактерий и цианотоксинов, стратегия упрощается, сокращая общее число до четырех основных этапов: 1) дистанционное и проксимальное зондирование и анализ данных для первого обследования, локализация участков и определение характера цветения и расширения; 2) управляемая выборка; 3) микроскопические наблюдения и таксономический анализ; (4) Химический анализ и молекулярное объединение данных LC-MS для дерепликации проб воды и быстрого обнаружения цианотоксинов.

Что касается первого шага, то даже если наличие данных, полученных с помощью всей цепочки платформ, которые охватывают все уровни иерархического подхода к мониторингу, было бы наилучшим решением для воссоздания полного видения анализируемого сценария, часто только один информационный слой может стимулировать действия по обследованию района и эффективно фокусироваться на горячих точках для выполнения действий по отбору проб на месте. Согласно сообщенным опытам, в которых данные были получены с использованием спутников, самолетов, вертолетов, БПЛА, решением, которое полностью соответствует потребностям, требуемым стратегией быстрого обнаружения, является использование единственных спутниковых продуктов.

Кроме того, информационные слои, полученные от миссий, выполняемых платформами, которые летают на меньших высотах, чем спутники (например, самолеты, вертолеты, БПЛА), восстанавливают информацию с большим разрешением, но они очень дороги и также требуют больше времени для завершения полного процесса сбора, который также включает в себя определение и утверждение плана полета.

После отбора образцов (этап 2) аналитический/биоинформатический анализ (молекулярная сеть данных LC-MS) является инструментом для быстрой дерепликации проб воды и быстрого обнаружения цианотоксинов (этапы 3 и 4). Метагеномный анализ 16S занимает не менее 2 недель работы. Более того, даже когда идентифицируются виды цианобактерий, которые являются в целом токсичными, их токсина не демонстрируется. По этой же причине микроскопическое наблюдение само по себе недостаточно для выявления наличия токсичных цианобактерий. Конечно, анализ РС и молекулярные сети имеют некоторые ограничения; они достаточно эффективны, если представляющие интерес соединения (например, токсины) хорошо ионизируются в применяемых условиях, если они находятся в достаточном количестве для обнаружения. Для целей обнаружения и мониторинга известных цианобактериальных токсинов молекулярная сеть на основе РС фактически представляет собой одну из наиболее надежных и надежных технологий.

Поэтому такой подход оказывается весьма полезным, когда необходимо быстрое обнаружение цианобактерий и родственных цианотоксинов; кроме того, количественная оценка как цветения цианобактерий, так и токсина в пространстве и времени также возможна благодаря этой стратегии для предотвращения проблем медицинских сообществ, которые могут возникнуть в результате крупных токсичных цветов цианобактерий.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование финансировалось “Centro di Riferimento Regionale per la Sicurezza Sanitaria del Pescato (CRiSSaP)” в рамках проекта “Attività pilota di Monitoraggio di Cianobatteri nella fascia costiera della regione Campania” и выполнено в сотрудничестве с Агентством по охране окружающей среды региона Кампания, Италия (ARPAC), “Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno/Osservatorio Regionale per la Sicurezza Alimentare” (IZSM/ORSA), Университет Неаполя “Federico II” – Департамент ветеринарной медицины и животноводства, профессор А. Анастасио).

Materials

10X Vitamin mix			Nicotinic acid 100 mg/100 mL; PABA 10 mg/100 mL; Biotin 1 mg/100 mL; Thiamine 200 mg/100 mL; B₁₂ 1 mg/100 mL; Folic Acid 1 mg/100 mL; i-inositol 1 mg/100 mL; Ca-pantothenate 100 mg/100 mL
1-BuOH	Sigma-Aldrich	33065.2.5L-R
BG11 stock solution			Na₂EDTA 20 mg/L; Ferric ammonium citrate 120 mg/L; Citric acid·1H₂O 120 mg/L; CaCl₂·2H₂O 700 mg/L, MgSO₄·7H₂O 1.5 g/L, K₂HPO₄·3H₂O 800 mg/L, NiSO₄(NH₄)2SO₄·6H₂O (0.1 mM stock) 5 mL; Na₂SeO₄ (0.1 mM stock) 2 mL, Nitsch's Solution 20 mL
Centrifuge	Hermle	Z36HK
CHCl₃	Honeywell	32211.2.5L
H₂O	Sigma-Aldrich	34877.2.5L
Kinetex C18 cloumn	Phenomenex
LTQ Orbitrap XL high-resolution ESI mass spectrometer coupled to a U3000 HPLC system	Thermo
MeOH	Honeywell	32213.2.5L
Microscope equipped with an OMAX 18 MP CMOS camera	Optech	Biostar B3
Multiband camera	Intergraph DMC
Nitsch's Solution			H₃BO₃0.5 g/L MnSO₄· H₂O 2.28 g/L ZnSO₄·7H₂O 0.5 g/L CuSO₄·5H₂O 0.025 g/L COCl₂·6H₂O 0.135 g/L Na₂MoO₄·2H₂O 0.025 g/L
Refractomer mr 100 ATC	AQL
SWBG11 medium			BG11 stock solution 50 mL/L; Instant Ocean 33 g/L; Water 950 mL/L 10X; Vitamin mix 100 µL/L

References

Tamele, I. J., Silva, M., Vasconcelos, V. The incidence of marine toxins and the associated seafood poisoning episodes in the African countries of the Indian ocean and the Red sea. Toxins. 11 (1), 25-48 (2019).
Lürling, M., Faassen, E. J. Dog poisonings associated with a Microcystis aeruginosa bloom in the Netherlands. Toxins. 5 (3), 556-567 (2013).
O’Neil, J. M., Davis, T. W., Burford, M. A., Gobler, C. J. The rise of harmful cyanobacteria blooms: The potential roles of eutrophication and climate change. Harmful Algae. 14, 313-334 (2012).
Teta, R., et al. Cyanobacteria as indicators of water quality in Campania coasts, Italy: A monitoring strategy combining remote/proximal sensing and in situ data. Environmental Research Letters. 12 (2), (2017).
Teta, R. Bioindicators as a tool in environmental impact assessment: Cyanobacteria as a sentinel of pollution. International Journal of Sustainable Development and Planning. 14 (1), 1-8 (2019).
Teta, R., Della Sala, G., Mangoni, A., Lega, M., Costantino, V. Tracing cyanobacterial blooms to assess the impact of wastewaters discharges on coastal areas and lakes. International Journal of Sustainable Development and Planning. 11 (5), 804-811 (2016).
Teta, R., et al. A joint molecular networking study of a: Smenospongia sponge and a cyanobacterial bloom revealed new antiproliferative chlorinated polyketides. Organic Chemistry Frontiers. 6 (11), 1762-1774 (2019).
Singh, R. K., Tiwari, S. P., Rai, A. K., Mohapatra, T. M. Cyanobacteria: an emerging source for drug discovery. Journal of Antibiotics. 64 (6), 401-412 (2011).
Huisman, J., et al. Cyanobacterial blooms. Nature Reviews Microbiology. 16 (8), 471-483 (2018).
Gupta, N., Pant, S. C., Vijayaraghavan, R., Rao, P. V. L. Comparative toxicity evaluation of cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin variants (LR, RR, YR) in mice. Toxicology. 188 (2-3), 285-296 (2003).
WHO. Cyanobacterial toxins: Microcystin-LR in drinking water. Background document for development of WHO Guidelines for Drinking-Water Quality. WHO. 2, (1998).
Agha, R., Cirés, S., Wörmer, L., Domínguez, J. A., Quesada, A. Multi-scale strategies for the monitoring of freshwater cyanobacteria: Reducing the sources of uncertainty. Water Research. 46 (9), 3043-3053 (2012).
Giménez-Campillo, C. Determination of cyanotoxins and phycotoxins in seawater and algae-based food supplements using ionic liquids and liquid chromatography with time-of-flight mass spectrometry. Toxins. 11 (10), 610 (2019).
Sanseverino, I., António, D. C., Loos, R., Lettieri, T. Cyanotoxins: methods and approaches for their analysis and detection. JRC Technical Reports. , (2017).
Teta, R. Combined LC-MS/MS and molecular networking approach reveals new cyanotoxins from the 2014 cyanobacterial bloom in Green Lake, Seattle. Environmental Science and Technology. 49 (24), 14301-14310 (2015).
Esposito, G., et al. A fast detection strategy for cyanobacterial blooms and associated cyanotoxins (FDSCC) reveals the occurrence of lyngbyatoxin A in campania (South Italy). Chemosphere. 225, 342-351 (2019).
Lega, M., Casazza, M., Teta, R., Zappa, C. J. Environmental impact assessment: a multilevel, multi-parametric framework for coastal waters. International Journal of Sustainable Development and Planning. 13 (8), 1041-1049 (2018).
Di Fiore, V. Integrated hierarchical geo-environmental survey strategy applied to the detection and investigation of an illegal landfill: A case study in the Campania Region (Southern Italy). Forensic Science International. 279, 96-105 (2017).
Gargiulo, F., Persechino, G., Lega, M., Errico, A. IDES project: A new effective tool for safety and security in the environment. Lecture Notes in Computer Science (including subseries Lecture Notes in Artificial Intelligence and Lecture Notes in Bioinformatics). , (2013).
Ferrara, C., Lega, M., Fusco, G., Bishop, P., Endreny, T. Characterization of terrestrial discharges into coastal waters with thermal imagery from a hierarchical monitoring program. Water. 9 (7), (2017).
Alfeo, A. L., Cimino, M. G. C. A., De Francesco, N., Lega, M., Vaglini, G. Design and simulation of the emergent behavior of small drones swarming for distributed target localization. Journal of Computational Science. 29, 19-33 (2018).
Casazza, M., Lega, M., Liu, G., Ulgiati, S., Endreny, T. A. Aerosol pollution, including eroded soils, intensifies cloud growth, precipitation, and soil erosion: a review. Journal of Cleaner Production. 189, 135-144 (2018).
. U.S. Geological Survey Available from: https://ers.cr.usgs.gov (2020)
. NASA Earthdata Available from: https://urs.earthdata.nasa.gov (2020)
. Copernicus Opern Access Hub Available from: https://scihub.copernicus.eu/apihub (2020)
Chen, H. -. H., Tang, R., Zhang, H. -. R., Yu, Y., Wang, Y. Investigating the relationship between sea surface chlorophyll and major features of the south china sea with satellite information. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), (2020).
. QGIS Available from: https://www.qgis.org/it/site/ (2020)
. Semi-automatic classification plugin documentation release 4.8.0.1 Available from: https://manualzz.com/doc/7130012/semi-automatic-classification-plugin-documentation (2016)
Rouse, J. W., Hass, R. H., Schell, J. A., Deering, D. W. Monitoring vegetation systems in the great plains with ERTS. Third Earth Resources Technology Satellite (ERTS) Symposium. 1, 309-317 (1973).
Carmona, F., Rivas, R., Fonnegra, D. C. Vegetation index to estimate chlorophyll content from multispectral remote sensing data. European Journal of Remote Sensing. 48 (1), 319-326 (2015).
Savtchenko, A., et al. MODIS data from terra and aqua satellites. International Geoscience and Remote Sensing Symposium (IGARSS). 5, 3028-3030 (2003).
Binding, C. E., Greenberg, T. A., McCullough, G., Watson, S. B., Page, E. An analysis of satellite-derived chlorophyll and algal bloom indices on Lake Winnipeg. Journal of Great Lakes Research. 44 (3), 436-446 (2018).
Komárek, J., Kaštovský, J., Mareš, J., Johansen, J. R. Taxonomic classification of cyanoprokaryotes (cyanobacterial genera) 2014, using a polyphasic approach. Preslia. 86, 295-335 (2014).
Esposito, G., et al. Chlorinated thiazole-containing polyketide-peptides from the caribbean sponge smenospongia conulosa: structure elucidation on microgram scale. European Journal of Organic Chemistry. 2016 (16), 2871-2875 (2016).
Shannon, P. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Research. 13 (11), 2498-2504 (2003).
Sigrist, R., Paulo, B. S., Angolini, C. F. F., De Oliveira, L. G. Mass spectrometry-guided genome mining as a tool to uncover novel natural products. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Teta, R., Esposito, G., De Sterlich, C., Lega, M., Costantino, V. Early Detection of Cyanobacterial Blooms and Associated Cyanotoxins using Fast Detection Strategy. J. Vis. Exp. (168), e61889, doi:10.3791/61889 (2021).

Automatically Generated