Early Detection of Cyanobacterial Blooms and Associated Cyanotoxins using Fast Detection Strategy

Roberta Teta; Germana Esposito; Carlo De Sterlich; Massimiliano Lega; Valeria Costantino

doi:10.3791/61889

JoVE Journal > Chemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Chemistry

Früherkennung von Cyanobakterienblüten und assoziierten Cyanotoxinen mit Fast Detection Strategy

Published: February 25, 2021

doi:

10.3791/61889

Roberta Teta¹, Germana Esposito¹, Carlo De Sterlich², Massimiliano Lega*³, Valeria Costantino*¹

¹TheBlueChemistryLab, Department of Pharmacy,University of Naples Federico II, ²Department of Public Health,University of Naples Federico II, ³Department of Engineering,University Parthenope

Summary

Eine schnell-multidisziplinäre Strategie zur Früherkennung von Cyanobakterienblüten und assoziierten Cyanotoxinen wird hier beschrieben. Es ermöglicht den Nachweis von Cyanobakterien und verwandten Cyanotoxinen in Wasserproben und in organischen Matrizen, wie z.B. Muschelproben, in 24 h.

Abstract

Der schnelle Nachweis von Cyanobakterien und Cyanotoxinen wird mit einer Fast Detection Strategy (FDS) erreicht. Nur 24 Stunden sind erforderlich, um das Vorhandensein von Cyanobakterien und verwandten Cyanotoxinen in Wasserproben und in einer organischen Matrix wie Muschelextrakten zu entschlüsseln. FDS kombiniert Fern-/Proximalsensortechniken mit analytischen/bioinformatischen Analysen. Die Auswahl der Probenahmestellen wird durch multidisziplinäre, multiskalige und multiparametrische Überwachung in einem dreidimensionalen physischen Raum, einschließlich Fernerkundung, ausgewählt. Die mikroskopische Beobachtung und taxonomische Analyse der Proben wird im Labor durchgeführt, was die Identifizierung von Cyanobakterienarten ermöglicht. Die Proben werden dann mit organischen Lösungsmitteln extrahiert und mit LC-MS/MS verarbeitet. Die von MS/MS erhaltenen Daten werden mit einem bioinformatischen Ansatz unter Verwendung der Online-Plattform Global Natural Products Social (GNPS) analysiert, um ein Netzwerk von Molekülen zu schaffen. Diese Netzwerke werden analysiert, um Toxine zu erkennen und zu identifizieren, wobei Daten der fragmentierten Spektren, die durch Massenspektrometrie erhalten wurden, mit der GNPS-Bibliothek verglichen werden. Dies ermöglicht den Nachweis bekannter Toxine und unbekannter Analoga, die im selben molekularen Netzwerk verwandt erscheinen.

Introduction

Cyanobakterienblüten haben sich in den letzten 15 Jahren weltweit zu einem Umweltproblem entwickelt¹^,². Cyanobakterienblüten sind auf das Überwachsen von Mikroorganismen zurückzuführen, die Cyanobakterien genannt werden. Sie sind eine auffällige Gruppe von photosynthetischen Mikroorganismen, die sich angepasst haben, um in einer Vielzahl von Umgebungen zu leben, einschließlich tropischer Gebiete und extrem kalter Gewässer. Sie sind dafür bekannt, große Blüten zu produzieren, die Wasseroberflächen bedecken, insbesondere als Reaktion auf eine massive Anreicherung von Nährstoffen, den sogenannten Eutrophierungsprozess³.

Daher sind Cyanobakterien ausgezeichnete Bioindikatoren für Wasserverschmutzung⁴^,⁵^,⁶. Sie können auch eine breite Palette von natürlichen Verbindungen mit interessanten pharmakologischen Eigenschaften^{herstellen 7}^,⁸. Das Umweltproblem im Zusammenhang mit Cyanobakterien sind die Blüten selbst. Blüten können das Sonnenlicht von Unterwassergräsern blockieren, Sauerstoff im Wasser verbrauchen, was zu Fischtötungen führt, Oberflächenabschaum und Gerüche erzeugen und die Filterfütterung von Organismen stören⁹.

Darüber hinaus und noch schwerwiegender, in einer bestimmten Kombination von Faktoren wie Temperatur, Nährstoffen (Phosphor und Stickstoff), Sonnenlicht (für die Photosynthese) und pH-Wert des Wassers, lösen Cyanobakterienblüten die Toxinproduktion aus; daher werden sie schädlich für Mensch und Tier. Die am besten untersuchte Klasse von Cyanotoxinen wird von den Gattungen Microcystis produziert. Dies sind zyklische Peptide, die unter dem allgemeinen Namen Microcystine (MCs) bekannt sind: Microcystin-LR ist das am meisten untersuchte, um schwere Hepatoxizität zu erzeugen¹⁰. Tiere und Menschen können durch die Aufnahme von kontaminiertem Trinkwasser oder Lebensmitteln MCs ausgesetzt sein. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) schlug als Leitlinie¹¹einen Mikrocystin-LR-Gesamtwert von 0,001 mg/L vor. Dies hängt jedoch nur mit einer Variante (d.h. MC-LR) von mehr als 100 Mikrocystinen zusammen, die bisher isoliert wurden.

Kombinierte Methoden, über die zuvor berichtet wurde, wie die Fernerkundung mit MALDI-TOF MS-Analyse¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵, haben sich auf die Konzentrationsdetektion von MCs konzentriert. Die neuesten Methoden verwenden Sensoren mit niedriger Auflösung, die nur große Blütenflächen effektiv erkennen; sie sind auch in der Lage, nur Toxine aufzudecken, für die Standards verfügbar sind. Darüber hinaus sind die meisten dieser Verfahren zeitaufwendig, und Zeit ist ein dramatischer Faktor für die Früherkennung der Blüte, um Sicherheitsprobleme zu vermeiden oder zu minimieren. Die hier vorgeschlagene multidisziplinäre Strategie sieht einen schnellen Nachweis von Cyanobakterienblüte und Cyanotoxinen nach nur 24 h^{16 vor.}

Im Rahmen des Programms muM3 , “Multi-disciplinary, Multi-scale and Multi-parametric Monitoring in the three-dimensional (3D) physical space”¹⁷^,¹⁸, kombiniert eine Fast Detection Strategy (FDS) die Vorteile mehrerer Techniken: 1) Fernerkundung zur Erkennung der Blüte; 2) mikroskopische Beobachtung zum Nachweis von Cyanobakterienarten; und 3) analytische/bioinformatische Analysen, nämlich LC-HRMS-basierte molekulare Vernetzung, um Cyanotoxine nachzuweisen. Die Ergebnisse werden innerhalb von 24 h erzielt.

Der neue Ansatz ist nützlich, um weite Küstengebiete in kurzer Zeit zu überwachen, zahlreiche Probenahmen und Analysen zu vermeiden und die Nachweiszeit und -kosten zu reduzieren. Diese Strategie ist das Ergebnis der Untersuchung und Anwendung verschiedener Ansätze zur Überwachung von Cyanobakterien und ihren Toxinen und kombiniert die Vorteile jedes von ihnen. Insbesondere die Analyse der Ergebnisse, die aus der Verwendung verschiedener Plattformen (Satellit, Flugzeuge, Drohnen) und Sensoren (MODIS, thermisches Infrarot) für die Fernerkundungsanalyse stammen, wie z.B. verschiedener methodischer Ansätze zur Identifizierung von Cyanobakterienspezies (Mikroskop, UV-Vis-Spektroskopie, 16S-Analyse) und Toxinen (LC-MS-Analyse, molekulare Vernetzung), ermöglichte die Auswahl der am besten geeigneten Methode sowohl für die spezifischen als auch für die allgemeinen Zwecke. Die neue Methodik wurde in nachfolgenden Überwachungskampagnen an den Küsten Kampaniens (Italien) im Rahmen des Überwachungsprogramms der Umweltschutzbehörde Kampaniens erexperimentiert und validiert.

Abbildung 1: FDS-Strategie. Eine Übersicht über die Schnellnachweisstrategie für Cyanobakterien und Cyanotoxine. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protocol

1. Fernerkundung und proximale Sensorik: Datenerfassung und -analyse HINWEIS: In diesem Fall werden Fernerkundungsdaten für eine erste Makrogebietsuntersuchung und zur Auswahl bestimmter Stellen von Küstengebieten verwendet, die beprobt werden sollen. Im MuM3 Framework17-Schema basiert der Logikfluss auf einem hierarchischen Überwachungsmodell, das mehrere Ebenen mit den Namen Information Layer umfasst. Die Informationen jeder Ebene basieren auf Daten, die mit einem oder mehreren Sensoren erfasst wurden, die an Bord von Plattformen in verschiedenen Höhen transportiert werden. Jede Ebene definiert eine räumliche Skala in Abhängigkeit von der Höhe der Messung19. Es besteht das Potenzial für mehrere Sensoren auf jeder Ebene. Einige Beispiele sind: sichtbares Nahinfrarot (VNIR) und thermisches Infrarot (TIR) Bildgebung20 auf Satelliten, Flugzeugen, Hubschraubern, UAV21 und an der Oberfläche; physikalische, chemische und biologische Analysen usw.22 an der Oberfläche und in schneller Reaktion mit dem mobilen Labor. Die von jedem Sensor erfassten Daten werden verarbeitet und kombiniert, um multispektrale Indizes zu berechnen (z. B. Normalized Difference Vegetation Index (NDVI), Normalized Difference Water Index (NDWI), Chlorophyll Index usw.), so dass die Rohdaten in nützlichere Parameter und Formate (z. B. thematische Karte) konvertiert werden. Abbildung 2: Fern-/proximale Sensoranalysen für die Probenahme (Schritte 1-2). Mehrstufiger und multisensorischer Ansatz zum Nachweis von Cyanobakterienblüten. Die Datenerfassung erfolgt durch Satellit (A), Flugzeug (B) und / oder Drohne (C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Datenabruf mit Fernerkundung und proximaler Erfassung Abrufen von Daten aus den verschiedenen öffentlichen und privaten Fernerkundungsdatensätzen, die speziell für den inhaltsbasierten Abruf und die Szenenklassifizierung erstellt wurden. Typische Datensatzquellen, die in diesem Schritt verwendet werden, sind: Landsat-Produkte des U.S. Geological Survey23, Sentinel-2,3-Produkte der NASA24und Copernicus Open Access Hub25, MODIS-Aqua26. Identifizieren Sie die Produkte, die für das spezifische Gebiet und den Datumsbereich verfügbar sind, und berücksichtigen Sie die grenze, die sich aus der Wolkendecke ergibt. Definieren: A) der Interessenbereich mithilfe der grafischen Benutzeroberfläche und der Polygonauswahl; B) den Datumsbereich und die Wolkenabdeckung unter Verwendung der Textabfragefilterfelder.HINWEIS: Auch wenn viele wissenschaftliche Berichte zitieren, dass ein akzeptabler Wolkenbedeckungswert <20% beträgt, ist es bei dieser Art von Forschung wichtig, nur auf die tatsächliche Wolkenbedeckung auf der Wasseroberfläche zu achten, so dass ein Wirksamkeitswert für diese Region <5% beträgt. Wählen Sie Produkte aus, die von den Plattformen abgeleitet sind, die den spezifischen Anforderungen der Mission am besten entsprechen. Aus jeder Kombination von technischen Spezifikationen für Satellit und Nutzlast ist es möglich, mehrere Produktsammlungen zu erhalten. Zum Beispiel werden die NASA EOSDIS24 Datenprodukte auf verschiedenen Ebenen von Level 0 bis Level 4 verarbeitet: Die Level 0 Produkte sind Rohdaten mit voller Instrumentenauflösung, während auf höheren Ebenen die Daten in nützlichere Parameter und Formate umgewandelt werden. Normalerweise sind die Stufen 0-1 verfügbar, während die Produkte in den Stufen 2-4 eine spezifische Verarbeitung in Bezug auf bestimmte Forschungsziele benötigen, so dass ihre Verfügbarkeit zeitlich begrenzt ist und die Region abgedeckt ist. Laden Sie den ausgewählten Datensatz der Satellitenbeobachtungen herunter. Im Detail, indem Sie aus der Liste der Ergebnisse der vorherigen Aktion auswählen, laden Sie ein vollständiges Datensatzprodukt (z. B. eine Gruppe von Geo-Tiff-Dateien, eine für jedes Band sowie Infos und andere Metadaten) oder nur ein bestimmtes einzelnes Band herunter.HINWEIS: Für die spezifische Beschreibung jeder grundlegenden Aktion, die im Verfahren von Schritt 1 enthalten ist, lesen Sie bitte auch Huan-Huan Chen et al. 202027. Datenvorverarbeitung und -verarbeitung für die Analyse und Umwandlung in nützlichere Parameter und Formate, um ein erstes Screening des Makrobereichs zu ermöglichen.HINWEIS: Die folgenden Aktionen (Schritt 1.2) sind der Datenverarbeitung gewidmet, um Rohdaten aus niedrigeren Ebenen in Informationen und dann in nützliche Informationen (höhere Ebenen) umzuwandeln. Dieser Schritt besteht aus der Verarbeitung der Rohdaten jedes Sensors (z. B. Produktebenen 0-1) und der Umwandlung in übergeordnete Produkte (z. B. Ebenen 2-4) und anschließend in Informationsebenen, um nützlichere Parameter und Formate (z. B. thematische Karte) zu generieren. Vorverarbeitung von Rohdaten mit geometrischer und radiometrischer Kalibrierung. Diese Aktion könnte mit einer speziellen Software durchgeführt werden, die automatisch oder halbautomatisch (unbeaufsichtigt oder überwacht) eine Reihe verbundener Werkzeuge für die Rasterverarbeitung bereitstellt, um eine einfache Klassifizierung unter Berücksichtigung eines korrekten Workflows durchzuführen.HINWEIS: In dieser Studie werden zwei kostenlose Open-Source-Tools verwendet: Q-GIS 3.1428 kombiniert mit Semi-Automatic Classification Plugin (SCP). Das SCP-Plugin29 ermöglicht die halbautomatische Klassifizierung von Fernerkundungsbildern und bietet ein komplettes Toolset für den Download von kostenlosen Bildern, die Vorverarbeitung, die Nachbearbeitung und die Rasterberechnung. Verarbeiten Sie kalibrierte Daten zur Berechnung multispektraler Indizes. In der Regel wird diese Aktion mit einem Raster-Rechnerwerkzeug ausgeführt. Die Berechnung eines multispektralen Index definiert eine Korrelation zwischen verschiedenen Bändern/Layern, die dadurch einen neuen Layer generiert, der auf einer GIS-Plattform verwaltet werden könnte. Ausgehend von Sentinel und Landsat Operational Land Imager Sensor (OLI) ist es beispielsweise möglich, multispektrale Indizes wie den Normalized Difference Vegetation Index (NDVI) zu berechnen. Der Vegetationsindex wird dann verwendet, um den Chlorophyllgehalt30,31zu schätzen. Analysieren Sie die Ergebnisse der Schätzung des Chlorophyllgehaltsindex, der wie in falschen thematischen Karten dargestellt wird, und definieren Sie kritische Gebiete mit hoher Chlorophyllkonzentration. In dieser Studie wird eine Chlorophyll-a-Karte unter Verwendung des Datensatzes des MODIS-Sensors32erstellt, der auf Terra- und Aqua-Satellitenplattformen montiert ist. Die Probenahmestellen werden lokalisiert, wo abnormale Werte registriert werden.HINWEIS: Die Algenblütenflagge (die jeden spezifischen Punkt definiert) wird im Fernerkundungsbereich angehoben, wenn die Chl-a-Konzentration 20 mg/L33überschreitet. 2. Geführte Probenahmen HINWEIS: Die Auswahl der Probenahmestellen wird durch die Analyse von Fern- / proximalen Erfassungsschichten bestimmt, die es ermöglicht, Flecken in großen Küstengebieten auszuwählen. Da die Probenahme aufgrund der Toxizität von Microcystinen für die Anwender gefährlich sein könnte, sind Sicherheitsprobenahmeverfahren erforderlich. Insbesondere wird es benötigt, um die Bediener vor Aerosolinhalation und Hautkontakt zu schützen. Führen Sie dann eine Probenahme nach dem unten beschriebenen Verfahren durch. Tragen Sie eine Schutzbrille, eine FFP2-Maske, um das Einatmen von Aerosolen zu verhindern, und Schutzhandschuhe, um Hautkontakt zu verhindern. Sammeln Sie 0,5 L Wasser in dreifacher Ausfertigung an jedem Standort. Messen Sie den Salzgehalt für jede Probe mit einem Refraktometer. Legen Sie einen Tropfen der Probe auf das Refraktometer und lesen Sie den Salzgehaltswert in Teilen pro Tausend (ppt – ‰). Am Ende der Probenahme zuerst die Hände waschen; Entfernen Sie dann wiederum die Handschuhe, die Maske und die Brille und achten Sie darauf, die Außenfläche der persönlichen Schutzausrüstung nicht zu berühren. Tragen Sie die Probe bei Raumtemperatur ins Labor. 3. Identifizierung von Cyanobakterienarten durch mikroskopische Beobachtungen und taxonomische Identifizierung Zentrifugieren Sie jede Probe (≈0,5 L) bei 11.200 x g für 5 min. Extrahieren Sie Überstände wie folgt: Gießen Sie 500 ml Butanol in jede Probe und übertragen Sie die zu extrahierende Mischung mit einem Trichter in den Trenntrichter. Legen Sie den Trenntrichter aufrecht in die Ringklemme, damit sich beide Schichten trennen können. Die wässrige Phase in einem Erlenmeyerkolben abtropfen lassen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. Anschließend die organischen Phasen unter Vakuum konzentrieren und wiegen. Sammeln Sie Pellets aus Schritt 3.1 und analysieren Sie sie bei 400- und 1.000-facher Vergrößerung mit einem optischen Mikroskop, das mit einer 18-MP-Digitalkamera für das Mikroskop ausgestattet ist. Suchen Sie nach dem Vorhandensein von Cyanobakterien auf der Grundlage ihrer morphologischen Merkmale: Blaugrüne Farbe, Zellform und Größe ermöglichen es, Cyanobakterien unter anderen Mikroorganismen zu erkennen. Identifizieren Sie die Art durch taxonomische Analyse durch mikroskopische Beobachtung nach dem in Komarék et al. 201434beschriebenen Verfahren.HINWEIS: Ergänzende 16S metagenomische Analysen können durchgeführt werden, um Cyanobakterientaxa3zu identifizieren. Verdünnen Sie ein Aliquot der Pellets mit 10 mL Meerwasser/ Süßwasser BG11 Medium, entsprechend seinem Salzgehalt, für den Anbau. 4. Identifizierung von Cyanotoxinen Extraktion von Proben mit organischen Lösungsmitteln Jede Pelletprobe in einen Kolben geben und 5 Min mit einem Eisbad beschallen. Dann 50 ml frisches MeOH hinzufügen und vorsichtig schütteln. Filtern Sie die Lösung mit einem Papierfilter und sammeln Sie das Filtrat in einem runden Bodenkolben. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Dann extrahieren Sie die Pellets mit einer Mischung aus MeOH / DCM zweimal (1: 1, 50 ml) und zweimal mit 100% DCM (x2, 50 ml)35. Beschriften Sie jeden Rundkolben als “MeOH-Extrakt”, “MeOH/DCM-Extrakt” und “DCM-Extrakt” und konzentrieren Sie ihn unter Vakuum. Analysieren Sie jeden organischen Extrakt (MeOH, MeOH/DCM, DCM) mit LC-HRMS/MS. LC-HRMS/MS-Analyse LC-HRMS und LC-HRMS/MS Probenvorbereitung: Lösen Sie jede Probe mit MeOH ≥ 99,9% auf, um eine Endkonzentration von 10 mg/ml zu erhalten. Analysieren Sie jede Probe mit einem hochauflösenden ESI-Massenspektrometer in Verbindung mit einem HPLC-System (LC-HRMS/MS-System). Arbeiten Sie an der HPLC mit einer 5-μm C18-Säule (100 x 2,10 mm) bei Raumtemperatur. Verwenden Sie eine Gradientenelution mit H2O (ergänzt mit 0,1% HCOOH) und MeOHat 200 μL min-1. Das Gradientenprogramm ist: 10% MeOH für 3 min, 10% bis 100% MeOH für 30 min, 100% MeOH für 7 min. Verwenden Sie MeOH als Steuerung. Datenerfassung. Datenerfassung im datenabhängigen Erfassungsmodus (DDA): Die 10 intensivsten Ionen eines Full-Scan-Massenspektrums müssen einer hochauflösenden Tandem-Massenspektrometrie (HRMS/MS) unterzogen werden. Erfassen Sie HRMS/MS-Scans für ausgewählte Ionen mit CID-Fragmentierung, einer Isolationsbreite von 2,0, einer normalisierten Kollisionsenergie von 35, Aktivierung Q von 0,250 und einer Aktivierungszeit von 30 ms. Bioinformatische Analysen und molekulare Vernetzung Analysieren Sie Fragmentierungsmuster für jedes intensive Ion mit MS-spezifischer Software. Verwenden Sie MS-Cluster, um die Daten zu clustern (übergeordnete Massentoleranz von 1,0 Da und MS/MS-Fragmentionentoleranz von 0,5 Da). Konsensspektren, die weniger als 2 Spektren enthalten, werden eliminiert. Analysieren Sie MS/MS-Daten nach GNPS (Global Natural Products Social36)für molekulare Vernetzung. Paarweise vergleichen Konsensspektren und auch mit denen, die in den GNPS-Mass-Ive-Bibliotheken berichtet werden. Visualisieren Sie das erhaltene Netzwerk37.HINWEIS: Zur molekularen Vernetzung siehe Sigrist et al. 202038. Abbildung 3:FDS-Laborschritte (3-4). Visuelle Darstellung der wichtigsten Tätigkeiten im Labor nach der Probenahme (Schritte 3 und 4). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Representative Results

In einer ersten Studie3wurden im Sommer 2015 vier anthropogen beeinflusste Standorte entlang der Küste Kampaniens in SW Italien mit satellitengestütztem Landsat 8 und Flugzeugen beobachtet. Der Operation Landsat 8 Land Imager Sensor (OLI) und die Multispektralkamera des Flugzeugs ermöglichten es, NDWI-Bilder (Normalized Difference Water Index) für die Gebiete zu erstellen, um das Vorhandensein von Cyanobakteriengemeinschaften aufzudecken. Die Zusammensetzung der Cyanobakteriengemeinschaft wurde durch spektralphotometrische Analysen zum Nachweis des Cyanobakterienpigments Phycocyanin (PC) bestimmt. Dann erlaubte die ergänzende 16S-Metagenomanalyse, Cyanobakterientaxa zu identifizieren. Die vereinfachte multispektrale Bildindizierung und -klassifizierung durch Satelliten-/Hubarbeitsbühnen in Kombination mit metagenomischen Analysen war wirksam, um das Vorhandensein von Cyanobakterien aus Gattungen mit starken eutrophen Erkrankungen (wie Leptolyngbya sp., Pseudooscillatoria sp.) in einem frühen Stadium der Blüte nachzuweisen. In einer zweiten Studie14wurde der FDS-Ansatz im Frühjahr/Sommer 2017 getestet. Satellitendaten wurden als einzige Fernerkundungsebene verwendet. Im Detail ermöglichten die daten des MODerate Image Spectroradiometer (MODIS)-Sensors, der auf den Satellitenplattformen Terra und Aqua montiert war, die Quantifizierung von Chlorophyll-a (Chl-a) in den Gewässern entlang der Küste Kampaniens und trieben die Wahl von zehn Probenahmestellen voran. Die Proben wurden im Labor durch mikroskopische Beobachtung und taxonomische Identifizierung verarbeitet und dann mit organischen Lösungsmitteln extrahiert. Organische Extrakte wurden durch LC-MS-MS-Analyse verarbeitet. Die von MS-MS erhaltenen Daten wurden mit einem bioinformatischen Ansatz analysiert, wobei die GNPS-Plattform verwendet wurde, um ein Netzwerk von Molekülen zu erstellen. Das Netzwerk wurde analysiert, um Toxine zu erkennen und zu identifizieren, wobei Daten der fragmentierten Spektren, die durch Massenspektrometrie erhalten wurden, mit der GNPS-Bibliothek verglichen wurden. Dies ermöglichte den Nachweis bekannter Toxine und unbekannter Analoga, die im selben molekularen Netzwerk verwandt erscheinen. Insbesondere wurde Lyngbyatoxin A, ein lipophiles Dermatotoxin, in allen Wasserproben und Muschelproben nachgewiesen; Im Lyngbyatoxin-A-Molekülcluster waren auch Knoten vorhanden, die mit keiner bekannten Verbindung der Lyngbyatoxin-Familie verwandt waren, was auf das Vorhandensein unbekannter Lyngbyatoxin-Analoga hindeutet. In den Proben wurden keine Mikrocystine und andere Toxine nachgewiesen. Alle Ergebnisse wurden innerhalb von 24 Arbeitsstunden erzielt. Abbildung 4: FDS-repräsentative Ergebnisse. Ein Beispiel für die Anwendung der FDS-Strategie an der Küste Kampaniens (Italien). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

In den letzten Jahren hat unser Team verschiedene Ansätze getestet und validiert, die es ermöglichten, das Vorhandensein von Cyanobakterien und Cyanotoxinen in Gewässern und Muscheln zu entschlüsseln. Die neu entwickelte Strategie stellt das Ergebnis dieser Studien dar. Die optimalen Techniken und Technologien, die zum Umfang der schnellen Erkennung passen, werden unter dem Hut eines einzigartigen Verfahrens gesammelt, das die Wirksamkeit jedes einzelnen Schritts maximiert. Das Zielgebiet, die Bloom-Erweiterung und die Wachstumsphase sind die treibende Kraft bei der Auswahl geeigneter Methoden und Technologien.

Wenn der schnelle Nachweis von Cyanobakterien und Cyanotoxinen im Vordergrund steht, wird die Strategie gestrafft, um die Gesamtzahl auf vier Hauptschritte zu reduzieren: (1) Fernerkundung und proximale Erfassung und Datenanalyse für eine erste Untersuchung, Lokalisierung von Standorten und Definition von Blütenmuster und -erweiterung; (2) Geführte Probenahme; (3) Mikroskopische Beobachtung und taxonomische Analyse; (4) Chemische Analyse und molekulare Vernetzung von LC-MS-Daten zur Entfälschung der Wasserproben und zum schnellen Nachweis von Cyanotoxinen.

In Bezug auf den ersten Schritt: Selbst wenn die Verfügbarkeit von Daten, die von einer vollständigen Kette von Plattformen erfasst werden, die alle Schichten des hierarchischen Überwachungsansatzes abdecken, die beste Lösung wäre, um eine vollständige Vision des analysierten Szenarios wiederhergestellt zu werden, kann oft nur eine Informationsschicht die Gebietserhebungsaktion vorantreiben und sich effektiv auf die Hot Spots konzentrieren, um In-situ-Stichprobenaktionen durchzuführen. Nach den berichteten Erfahrungen, bei denen Daten mit Satelliten, Flugzeugen, Hubschraubern und UAVs erfasst wurden, ist die Lösung, die den Anforderungen der schnellen Erkennungsstrategie vollständig entspricht, die Verwendung der einzigen Satellitenprodukte.

Darüber hinaus restituieren die Informationsschichten, die von Missionen abgeleitet werden, die von Plattformen durchgeführt werden, die in niedrigeren Höhen als Satelliten fliegen (z. B. Flugzeuge, Hubschrauber, UAVs), Informationen mit großer Auflösung, aber diese sind sehr teuer und benötigen auch mehr Zeit, um den vollständigen Erfassungsprozess abzuschließen, der auch die Definition und Genehmigung des Flugplans umfasst.

Nach Auswahl der zu untersuchenden Stellen (Schritt 2) sind analytische/bioinformatische Analysen (Molekulare Vernetzung von LC-MS-Daten) das Werkzeug zur schnellen Enteplikation der Wasserproben und zum schnellen Nachweis von Cyanotoxinen (Schritte 3 und 4). 16S metagenomische Analyse dauert mindestens 2 Wochen Arbeit. Selbst wenn Cyanobakterienarten identifiziert werden, die generisch toxisch sind, wird ihre Toxinproduktion nicht nachgewiesen. Aus dem gleichen Grund reicht die mikroskopische Beobachtung selbst nicht aus, um das Vorhandensein toxischer Cyanobakterien aufzudecken. Natürlich haben MS-Analyse und molekulare Vernetzung einige Einschränkungen; sie sind sehr effektiv, wenn interessante Verbindungen (z. B. Toxine) unter den angewandten Bedingungen gut ionisiert sind, wenn sie in ausreichender Menge vorhanden sind, um nachgewiesen zu werden. Für den bekannten Cyanobakterientoxinnachweis und die Überwachung stellt die MS-basierte molekulare Vernetzung tatsächlich eine der robusteren und zuverlässigeren Technologien dar.

Daher erweist sich dieser Ansatz als sehr nützlich, wenn ein schneller Nachweis von Cyanobakterien und verwandten Cyanotoxinen erforderlich ist; Darüber hinaus ist die Quantifizierung sowohl der Cyanobakterienblüte als auch des Toxins über Raum und Zeit durch diese Strategie möglich, um die Probleme von Gesundheitsgemeinschaften zu verhindern, die durch große toxische Cyanobakterienblüten entstehen könnten.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde vom “Centro di Riferimento Regionale per la Sicurezza Sanitaria del Pescato (CRiSSaP)” im Rahmen des Projekts “Attività pilota di Monitoraggio di Cianobatteri nella fascia costiera della regione Campania” finanziert und in Zusammenarbeit mit der Umweltschutzbehörde der Region Kampanien, Italien (ARPAC), “Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno/Osservatorio Regionale per la Sicurezza Alimentare” (IZSM/ORSA), Universität Neapel “Federico II” – Abteilung für Veterinärmedizin und Tierproduktion, Ref. Prof. A. Anastasio) durchgeführt.

Materials

10X Vitamin mix			Nicotinic acid 100 mg/100 mL; PABA 10 mg/100 mL; Biotin 1 mg/100 mL; Thiamine 200 mg/100 mL; B₁₂ 1 mg/100 mL; Folic Acid 1 mg/100 mL; i-inositol 1 mg/100 mL; Ca-pantothenate 100 mg/100 mL
1-BuOH	Sigma-Aldrich	33065.2.5L-R
BG11 stock solution			Na₂EDTA 20 mg/L; Ferric ammonium citrate 120 mg/L; Citric acid·1H₂O 120 mg/L; CaCl₂·2H₂O 700 mg/L, MgSO₄·7H₂O 1.5 g/L, K₂HPO₄·3H₂O 800 mg/L, NiSO₄(NH₄)2SO₄·6H₂O (0.1 mM stock) 5 mL; Na₂SeO₄ (0.1 mM stock) 2 mL, Nitsch's Solution 20 mL
Centrifuge	Hermle	Z36HK
CHCl₃	Honeywell	32211.2.5L
H₂O	Sigma-Aldrich	34877.2.5L
Kinetex C18 cloumn	Phenomenex
LTQ Orbitrap XL high-resolution ESI mass spectrometer coupled to a U3000 HPLC system	Thermo
MeOH	Honeywell	32213.2.5L
Microscope equipped with an OMAX 18 MP CMOS camera	Optech	Biostar B3
Multiband camera	Intergraph DMC
Nitsch's Solution			H₃BO₃0.5 g/L MnSO₄· H₂O 2.28 g/L ZnSO₄·7H₂O 0.5 g/L CuSO₄·5H₂O 0.025 g/L COCl₂·6H₂O 0.135 g/L Na₂MoO₄·2H₂O 0.025 g/L
Refractomer mr 100 ATC	AQL
SWBG11 medium			BG11 stock solution 50 mL/L; Instant Ocean 33 g/L; Water 950 mL/L 10X; Vitamin mix 100 µL/L

References

Tamele, I. J., Silva, M., Vasconcelos, V. The incidence of marine toxins and the associated seafood poisoning episodes in the African countries of the Indian ocean and the Red sea. Toxins. 11 (1), 25-48 (2019).
Lürling, M., Faassen, E. J. Dog poisonings associated with a Microcystis aeruginosa bloom in the Netherlands. Toxins. 5 (3), 556-567 (2013).
O’Neil, J. M., Davis, T. W., Burford, M. A., Gobler, C. J. The rise of harmful cyanobacteria blooms: The potential roles of eutrophication and climate change. Harmful Algae. 14, 313-334 (2012).
Teta, R., et al. Cyanobacteria as indicators of water quality in Campania coasts, Italy: A monitoring strategy combining remote/proximal sensing and in situ data. Environmental Research Letters. 12 (2), (2017).
Teta, R. Bioindicators as a tool in environmental impact assessment: Cyanobacteria as a sentinel of pollution. International Journal of Sustainable Development and Planning. 14 (1), 1-8 (2019).
Teta, R., Della Sala, G., Mangoni, A., Lega, M., Costantino, V. Tracing cyanobacterial blooms to assess the impact of wastewaters discharges on coastal areas and lakes. International Journal of Sustainable Development and Planning. 11 (5), 804-811 (2016).
Teta, R., et al. A joint molecular networking study of a: Smenospongia sponge and a cyanobacterial bloom revealed new antiproliferative chlorinated polyketides. Organic Chemistry Frontiers. 6 (11), 1762-1774 (2019).
Singh, R. K., Tiwari, S. P., Rai, A. K., Mohapatra, T. M. Cyanobacteria: an emerging source for drug discovery. Journal of Antibiotics. 64 (6), 401-412 (2011).
Huisman, J., et al. Cyanobacterial blooms. Nature Reviews Microbiology. 16 (8), 471-483 (2018).
Gupta, N., Pant, S. C., Vijayaraghavan, R., Rao, P. V. L. Comparative toxicity evaluation of cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin variants (LR, RR, YR) in mice. Toxicology. 188 (2-3), 285-296 (2003).
WHO. Cyanobacterial toxins: Microcystin-LR in drinking water. Background document for development of WHO Guidelines for Drinking-Water Quality. WHO. 2, (1998).
Agha, R., Cirés, S., Wörmer, L., Domínguez, J. A., Quesada, A. Multi-scale strategies for the monitoring of freshwater cyanobacteria: Reducing the sources of uncertainty. Water Research. 46 (9), 3043-3053 (2012).
Giménez-Campillo, C. Determination of cyanotoxins and phycotoxins in seawater and algae-based food supplements using ionic liquids and liquid chromatography with time-of-flight mass spectrometry. Toxins. 11 (10), 610 (2019).
Sanseverino, I., António, D. C., Loos, R., Lettieri, T. Cyanotoxins: methods and approaches for their analysis and detection. JRC Technical Reports. , (2017).
Teta, R. Combined LC-MS/MS and molecular networking approach reveals new cyanotoxins from the 2014 cyanobacterial bloom in Green Lake, Seattle. Environmental Science and Technology. 49 (24), 14301-14310 (2015).
Esposito, G., et al. A fast detection strategy for cyanobacterial blooms and associated cyanotoxins (FDSCC) reveals the occurrence of lyngbyatoxin A in campania (South Italy). Chemosphere. 225, 342-351 (2019).
Lega, M., Casazza, M., Teta, R., Zappa, C. J. Environmental impact assessment: a multilevel, multi-parametric framework for coastal waters. International Journal of Sustainable Development and Planning. 13 (8), 1041-1049 (2018).
Di Fiore, V. Integrated hierarchical geo-environmental survey strategy applied to the detection and investigation of an illegal landfill: A case study in the Campania Region (Southern Italy). Forensic Science International. 279, 96-105 (2017).
Gargiulo, F., Persechino, G., Lega, M., Errico, A. IDES project: A new effective tool for safety and security in the environment. Lecture Notes in Computer Science (including subseries Lecture Notes in Artificial Intelligence and Lecture Notes in Bioinformatics). , (2013).
Ferrara, C., Lega, M., Fusco, G., Bishop, P., Endreny, T. Characterization of terrestrial discharges into coastal waters with thermal imagery from a hierarchical monitoring program. Water. 9 (7), (2017).
Alfeo, A. L., Cimino, M. G. C. A., De Francesco, N., Lega, M., Vaglini, G. Design and simulation of the emergent behavior of small drones swarming for distributed target localization. Journal of Computational Science. 29, 19-33 (2018).
Casazza, M., Lega, M., Liu, G., Ulgiati, S., Endreny, T. A. Aerosol pollution, including eroded soils, intensifies cloud growth, precipitation, and soil erosion: a review. Journal of Cleaner Production. 189, 135-144 (2018).
. U.S. Geological Survey Available from: https://ers.cr.usgs.gov (2020)
. NASA Earthdata Available from: https://urs.earthdata.nasa.gov (2020)
. Copernicus Opern Access Hub Available from: https://scihub.copernicus.eu/apihub (2020)
Chen, H. -. H., Tang, R., Zhang, H. -. R., Yu, Y., Wang, Y. Investigating the relationship between sea surface chlorophyll and major features of the south china sea with satellite information. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), (2020).
. QGIS Available from: https://www.qgis.org/it/site/ (2020)
. Semi-automatic classification plugin documentation release 4.8.0.1 Available from: https://manualzz.com/doc/7130012/semi-automatic-classification-plugin-documentation (2016)
Rouse, J. W., Hass, R. H., Schell, J. A., Deering, D. W. Monitoring vegetation systems in the great plains with ERTS. Third Earth Resources Technology Satellite (ERTS) Symposium. 1, 309-317 (1973).
Carmona, F., Rivas, R., Fonnegra, D. C. Vegetation index to estimate chlorophyll content from multispectral remote sensing data. European Journal of Remote Sensing. 48 (1), 319-326 (2015).
Savtchenko, A., et al. MODIS data from terra and aqua satellites. International Geoscience and Remote Sensing Symposium (IGARSS). 5, 3028-3030 (2003).
Binding, C. E., Greenberg, T. A., McCullough, G., Watson, S. B., Page, E. An analysis of satellite-derived chlorophyll and algal bloom indices on Lake Winnipeg. Journal of Great Lakes Research. 44 (3), 436-446 (2018).
Komárek, J., Kaštovský, J., Mareš, J., Johansen, J. R. Taxonomic classification of cyanoprokaryotes (cyanobacterial genera) 2014, using a polyphasic approach. Preslia. 86, 295-335 (2014).
Esposito, G., et al. Chlorinated thiazole-containing polyketide-peptides from the caribbean sponge smenospongia conulosa: structure elucidation on microgram scale. European Journal of Organic Chemistry. 2016 (16), 2871-2875 (2016).
Shannon, P. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Research. 13 (11), 2498-2504 (2003).
Sigrist, R., Paulo, B. S., Angolini, C. F. F., De Oliveira, L. G. Mass spectrometry-guided genome mining as a tool to uncover novel natural products. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Teta, R., Esposito, G., De Sterlich, C., Lega, M., Costantino, V. Early Detection of Cyanobacterial Blooms and Associated Cyanotoxins using Fast Detection Strategy. J. Vis. Exp. (168), e61889, doi:10.3791/61889 (2021).

Automatically Generated