Early Detection of Cyanobacterial Blooms and Associated Cyanotoxins using Fast Detection Strategy

Roberta Teta; Germana Esposito; Carlo De Sterlich; Massimiliano Lega; Valeria Costantino

doi:10.3791/61889

JoVE Journal > Chemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Chemistry

Vroege detectie van cyanobacteriële bloei en bijbehorende cyanotoxinen met behulp van snelle detectiestrategie

Published: February 25, 2021

doi:

10.3791/61889

Roberta Teta¹, Germana Esposito¹, Carlo De Sterlich², Massimiliano Lega*³, Valeria Costantino*¹

¹TheBlueChemistryLab, Department of Pharmacy,University of Naples Federico II, ²Department of Public Health,University of Naples Federico II, ³Department of Engineering,University Parthenope

Summary

Een snel-multidisciplinaire strategie voor vroege detectie van cyanobacteriële bloei en bijbehorende cyanotoxinen wordt hier beschreven. Het maakt het mogelijk om cyanobacteriën en verwante cyanotoxinen in watermonsters en in organische matrices, zoals tweekleppigenmonsters, in 24 uur te detecteren.

Abstract

Snelle detectie van cyanobacteriën en cyanotoxinen wordt bereikt met behulp van een Fast Detection Strategy (FDS). Er is slechts 24 uur nodig om de aanwezigheid van cyanobacteriën en verwante cyanotoxinen in watermonsters en in een organische matrix, zoals tweekleppilaatextracten, te ontrafelen. FDS combineert remote/proximal sensing technieken met analytische/bioinformatica analyses. Bemonsteringsplekken worden gekozen door middel van multidisciplinaire, multischaal- en multiparametrische monitoring in een driedimensionale fysieke ruimte, inclusief teledetectie. Microscopische observatie en taxonomische analyse van de monsters worden uitgevoerd in de laboratoriumomgeving, waardoor cyanobacteriële soorten kunnen worden geïdentificeerd. Monsters worden vervolgens geëxtraheerd met organische oplosmiddelen en verwerkt met LC-MS/MS. Gegevens verkregen door MS/MS worden geanalyseerd met behulp van een bio-informatische aanpak met behulp van het online platform Global Natural Products Social (GNPS) om een netwerk van moleculen te creëren. Deze netwerken worden geanalyseerd om toxines te detecteren en te identificeren, waarbij gegevens van de fragmentatiespectra verkregen door massaspectrometrie worden vergeleken met de GNPS-bibliotheek. Dit maakt de detectie mogelijk van bekende toxines en onbekende analogen die gerelateerd lijken in hetzelfde moleculaire netwerk.

Introduction

Cyanobacteriële bloei is de afgelopen 15 jaar over de hele wereld als een milieuprobleem naar voren gekomen¹^,². Cyanobacteriële bloei is te wijten aan de overgroei van micro-organismen genaamd cyanobacteriën. Het is een opvallende groep fotosynthetische micro-organismen die zich hebben aangepast om in een groot aantal omgevingen te leven, waaronder tropische gebieden en extreem koud water. Ze staan bekend om het produceren van grote bloemen die wateroppervlakken bedekken, vooral als reactie op een enorme verrijking van voedingsstoffen, het zogenaamde eutrofiëringsproces³.

Daarom zijn cyanobacteriën uitstekende bio-indicatoren van watervervuiling^4,^5,⁶. Ze kunnen ook een breed scala aan natuurlijke verbindingen produceren met interessante farmacologische eigenschappen⁷^,⁸. Het milieuprobleem met betrekking tot cyanobacteriën zijn de bloemen zelf. Bloemen kunnen zonlicht blokkeren voor onderwatergrassen, zuurstof in het water consumeren wat leidt tot het doden van vissen, oppervlakte-uitschot en geuren produceren en interfereren met de filtervoeding van organismen⁹.

Bovendien, en nog ernstiger, in een specifieke combinatie van factoren zoals temperatuur, voedingsstoffen (fosfor en stikstof), zonlicht (voor de fotosynthese) en pH van het water, veroorzaken cyanobacteriële bloei de productie van toxines; daarom worden ze schadelijk voor mens en dier. De meest bestudeerde klasse van cyanotoxinen wordt geproduceerd door de geslachten Microcystis. Dit zijn cyclische peptiden die bekend staan onder de algemene naam microcystins (MC’s): microcystin-LR is het meest bestudeerd als zijnde in staat om ernstige hepatoxiciteit te produceren¹⁰. Dieren en mensen kunnen aan MC’s worden blootgesteld door inname van besmet drinkwater of voedsel. De Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) stelde een totale microcystin-LR-waarde van 0,001 mg/L voor als richtsnoer¹¹. Dit heeft echter slechts betrekking op één variant (d.w.z. MC-LR) van de meer dan 100 microcystinen die tot nu toe zijn geïsoleerd.

Gecombineerde methoden die eerder zijn gerapporteerd, zoals teledetectie met MALDI-TOF MS-analyse^12,^13,¹⁴^,^15,hebben zich gericht op de concentratiedetectie van MC’s. De meest recente methoden gebruiken sensoren met lage resolutie die effectief zijn in het detecteren van alleen brede bloeivlaktes; ze zijn ook in staat om alleen toxines aan het licht te laten waarvoor normen beschikbaar zijn. Bovendien zijn de meeste van deze procedures tijdrovend en is tijd een dramatische factor voor vroege detectie van de bloei om veiligheidsproblemen te voorkomen of te minimaliseren. De hier voorgestelde multidisciplinaire strategie biedt een snelle detectie van cyanobacteriënbloei en cyanotoxinen, na slechts 24 uur¹⁶.

In het kader van het programma genaamd MuM3, “Multi-disciplinary, Multi- scale and Multi-parametric Monitoring in the three-dimensional (3D) physical space”¹⁷^,¹⁸, combineert een Fast Detection Strategy (FDS) de voordelen van verschillende technieken: 1) remote sensing om de bloei te detecteren; 2) microscopische observatie om cyanobacteriënsoorten op te sporen; en 3) analytische/bioinformatica-analyses, namelijk lc-HRMS-gebaseerde moleculaire netwerken, om cyanotoxinen op te sporen. De resultaten worden binnen 24 uur verkregen.

De nieuwe aanpak is nuttig om in korte tijd brede kustgebieden te monitoren, talrijke bemonstering en analyses te vermijden en de detectietijd en -kosten te verminderen. Deze strategie is het resultaat van de studie en toepassing van verschillende benaderingen voor de monitoring van cyanobacteriën en hun toxines en combineert de voordelen van elk van hen. Met name de analyse van de resultaten, afkomstig van het gebruik van verschillende platforms (satelliet, vliegtuigen, drones) en sensoren (MODIS, thermisch infrarood) voor teledetectieanalyse, zoals van diverse methodologische benaderingen voor de identificatie van cyanobacteriële soorten (microscoop, UV-Vis spectroscopie, 16S-analyse) en toxines (LC-MS-analyse, moleculaire netwerken), maakte de selectie van de meest geschikte methode mogelijk, zowel voor de specifieke als voor algemene doeleinden. De nieuwe methodologie werd geëxperimenteerd en gevalideerd in daaropvolgende monitoringcampagnes aan de kusten van Campanië (Italië), in het kader van het monitoringprogramma van het Milieuagentschap van Campanië.

Figuur 1: FDS-strategie. Een overzicht van de snelle detectiestrategie voor cyanobacteriën en cyanotoxinen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Protocol

1. Remote en proximal sensing: data-acquisitie en -analyse OPMERKING: In dit geval worden remote/proximal sensing-gegevens gebruikt voor een eerste macro-gebiedsonderzoek en om specifieke plekken van kustgebieden te selecteren die moeten worden bemonsterd. In het MuM3 framework17-schema is de logische stroom gebaseerd op een hiërarchisch bewakingsmodel dat verschillende niveaus met de naam informatielagen bevat. De informatie van elk niveau is gebaseerd op gegevens die zijn verkregen met behulp van een of meer sensoren die aan boord van platforms op verschillende hoogten worden gedragen. Elk niveau definieert een ruimtelijke schaal afhankelijk van de hoogte van de meting19. Er is het potentieel voor meerdere sensoren op elk niveau. Enkele voorbeelden zijn: zichtbaar in de buurt van infrarood (VNIR) en thermische infrarood (TIR) beeldvorming20 op satellieten, vliegtuigen, helikopters, UAV21 en aan de oppervlakte; fysische, chemische en biologische analyses,enz. De gegevens die door elke sensor worden verkregen, worden verwerkt en gecombineerd om multispectrale indexen te berekenen (bijv. genormaliseerde verschilvegetatie-index (NDVI), Normalized Difference Water Index (NDWI), Chlorophyll Index, enz.), zodat de ruwe gegevens worden omgezet in nuttigere parameters en formaten (bijv. thematische kaart). Figuur 2: Analyse van externe/proximale detectie voor bemonstering (stappen 1-2). Multi-level en multi-sensor benadering voor de detectie van cyanobacteriële bloei. Gegevensverwerving wordt uitgevoerd door satelliet (A), vliegtuigen (B) en /of drone (C). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Gegevens op afstand en proximaal detecteren Haal gegevens op uit de verschillende openbare en privé remote sensing datasets, die speciaal zijn geproduceerd voor op inhoud gebaseerd ophalen en scèneclassificatie. Typische datasetbronnen die in deze stap worden gebruikt, zijn onder meer: Landsat-producten die worden geleverd door U.S. Geological Survey23, Sentinel-2,3-producten van NASA24en Copernicus Open Access Hub25, MODIS-Aqua26. Identificeer de producten die beschikbaar zijn voor het specifieke gebied, het datumbereik en houd rekening met de limiet die is afgeleid door de clouddekking. Definiëren: A) het interessegebied met behulp van grafische gebruikersinterface en polygoonselectie; B) het datumbereik en de clouddekking met behulp van de tekstqueryfiltervelden.OPMERKING: Zelfs als veel wetenschappelijke rapporten citeren dat een acceptabele bewolkingswaarde <20% is, is het in dit soort onderzoek belangrijk om alleen op het wateroppervlak aandacht te besteden aan de echte bewolking, dus een effectiviteitswaarde voor deze regio is <5%. Kies producten die zijn afgeleid van de platforms die het beste passen bij de specifieke behoeften van de missie. Van elke combinatie van satelliet- en payload-technische specificaties is het mogelijk om verschillende collecties producten te verkrijgen. De NASA EOSDIS24-gegevensproducten worden bijvoorbeeld verwerkt op verschillende niveaus, variërend van niveau 0 tot niveau 4: de level 0-producten zijn onbewerkte gegevens met volledige instrumentresolutie, terwijl op hogere niveaus de gegevens worden omgezet in nuttigere parameters en formaten. Meestal zijn de niveaus 0-1 beschikbaar, terwijl de producten in niveaus 2-4 specifieke verwerking nodig hebben met betrekking tot specifieke onderzoeksdoelen, zodat hun beschikbaarheid beperkt is in de tijd en de regio die wordt bestreken. Download de gekozen dataset van satellietwaarnemingen. In detail, als u een van de lijst met resultaten van de vorige actie selecteert, downloadt u een volledig gegevenssetproduct (bijvoorbeeld een groep geo-tiff-bestanden, één voor elke band, plus informatie en andere metagegevens) of slechts een specifieke enkele band.OPMERKING: Voor de specifieke beschrijving van elke basisactie die is opgenomen in de procedure van stap 1, verwijzen wij u ook naar Huan-Huan Chen et al. 202027. Gegevensvoorverwerking en -verwerking voor de analyse en transformatie in nuttigere parameters en formaten om een eerste screening van het macrogebied mogelijk te maken.OPMERKING: De volgende acties (stap 1.2) zijn gewijd aan gegevensverwerking die is voltooid om onbewerkte gegevens afkomstig van lagere niveaus om te zetten in informatie en vervolgens in nuttige informatie (hogere niveaus). Deze stap bestaat uit het verwerken van de ruwe gegevens van elke sensor (bijv. productniveaus 0-1) en transformatie naar producten op een hoger niveau (bijv. niveaus 2-4) en vervolgens in informatielagen om nuttigere parameters en formaten te genereren (bijv. thematische kaart). Ruwe gegevens voor verwerken met geometrische en radiometrische kalibratie. Deze actie kan worden uitgevoerd met behulp van specifieke software die op een automatische of semi-automatische manier (zonder toezicht of onder toezicht) een set verbonden tools voor rasterverwerking biedt om een eenvoudige classificatie uit te voeren met inachtneming van een juiste workflow.OPMERKING: In dit onderzoek worden twee gratis open source tools gebruikt: Q-GIS 3.1428 in combinatie met Semi-Automatic Classification Plugin (SCP). De SCP-plug-in29 maakt de semi-automatische classificatie van teledetectiebeelden mogelijk en biedt een complete toolset voor het downloaden van gratis afbeeldingen, de voorbewerking, de nabewerking en de rasterberekening. Gekalibreerde gegevens verwerken die multispectrale indexen berekenen. Deze actie wordt meestal uitgevoerd met een rastercalculator. De berekening van een multispectrale index definieert een correlatie tussen verschillende banden/lagen die als gevolg daarvan een nieuwe laag genereert die op een GIS-platform kan worden beheerd. Bijvoorbeeld, beginnend bij Sentinel en Landsat operationele land imager sensor (OLI), is het mogelijk om multispectrale indexen zoalsNormalized Difference Vegetation Index (NDVI) te berekenen. Vegetatie-index wordt vervolgens gebruikt om chlorofylgehalte30,31te schatten . Analyseer de resultaten verkregen uit de schatting van chlorofylgehalte-index weergegeven als in valse kleur thematische kaarten en definieer kritisch gebied met hoge chlorofylconcentratie. In deze studie wordt chlorofyl-a kaart gegenereerd met behulp van dataset van MODIS sensor32, gemonteerd op Terra en Aqua satellietplatforms. De bemonsteringspunten zijn gelokaliseerd waar abnormale waarden worden geregistreerd.OPMERKING: De algenbloeivlag (die elke specifieke plek definieert) wordt in het teledetectiedomein gehesen wanneer de Chl-a-concentratie hoger is dan 20 mg/L33. 2. Begeleide bemonstering OPMERKING: De keuze van bemonsteringspunten wordt gedreven door analyse van externe/proximale detectielagen waarmee vlekken in grote kustgebieden kunnen worden geselecteerd. Rekening houdend met het geval dat bemonstering gevaarlijk kan zijn voor de bedieners als gevolg van de toxiciteit van microcystinen, zijn veiligheidsbemonsteringsprocedures nodig. Het is met name nodig om operators te beschermen tegen inademing van aerosolen en huidcontact. Voer vervolgens een bemonstering uit volgens de onderstaande procedure. Draag een bril voor oogbescherming, FFP2-masker om inademing van aerosolen te voorkomen en veiligheidshandschoenen om huidcontact te voorkomen. Verzamel 0,5 L water in drievoud op elke locatie. Meet het zoutgehalte voor elk monster met behulp van een refractometer. Plaats een druppel van het monster op de refractometer en lees de zoutgehaltewaarde in termen van delen per duizend (ppt – ❏). Was aan het einde van de bemonstering eerst de handen; verwijder vervolgens op zijn beurt de handschoenen, het masker en de bril en zorg ervoor dat het externe oppervlak van de persoonlijke beschermingsmiddelen niet wordt aangeraakt. Breng het monster naar het lab bij kamertemperatuur. 3. Identificatie van cyanobacteriën door microscopische waarnemingen en taxonomische identificatie Centrifugeer elk monster (≈0,5 L) gedurende 5 minuten op 11.200 x g. Extraheer supernatanten als volgt: giet 500 ml butanol in elk monster en breng het te extraheren mengsel met behulp van een trechter over in de afscheidingstrechter. Plaats de afscheidingstrechter rechtop in de ringklem zodat beide lagen kunnen worden gescheiden. Laat de waterfase uitlekken in een Erlenmeyer. Herhaal deze stap drie keer. Concentreer vervolgens de organische fasen onder vacuüm en weeg ze. Verzamel pellets uit stap 3.1 en analyseer ze op 400x en 1.000x vergroting met een optische microscoop uitgerust met een 18 MP digitale camera voor microscoop. Zoek naar de aanwezigheid van cyanobacteriën op basis van hun morfologische kenmerken: blauwgroene kleur, celvorm en grootte maken het mogelijk om cyanobacteriën onder andere micro-organismen te herkennen. Identificeer de soort door taxonomische analyse door microscopische observatie, volgens de procedure beschreven in Komarék et al. 201434.OPMERKING: Aanvullende 16S metagenomische analyse kan worden uitgevoerd om cyanobacteriële taxa3te identificeren . Verdun een aliquot van de pellets met 10 ml zeewater/zoetwater BG11-media, afhankelijk van het zoutgehalte, voor de teelt. 4. Identificatie van cyanotoxinen Extractie van monsters met organische oplosmiddelen Doe elk monster pellet in een kolf en soniceer gedurende 5 minuten met behulp van een ijsbad. Voeg vervolgens 50 ml verse MeOH toe en schud zachtjes. Filtreer de oplossing met een papierfilter en verzamel het filtraat in een ronde bodemkolf. Herhaal deze stap twee keer. Haal vervolgens de pellets die twee keer een mengsel van 50 ml MeOH / DCM toevoegen (1: 1, 50 ml) en twee keer 100% DCM (x2, 50 ml)35. Etiketeer elke ronde bodemkolf respectievelijk als “MeOH-extract”, “MeOH/DCM-extract” en “DCM-extract” en concentreer u onder vacuüm. Analyseer elk organisch extract (MeOH, MeOH/DCM, DCM) door LC-HRMS/MS. LC-HRMS/MS-analyse LC-HRMS en LC-HRMS/MS monstervoorbereiding: los elk monster op met MeOH ≥ 99,9% om een eindconcentratie van 10 mg/ml te krijgen. Analyseer elk monster met behulp van een ESI-massaspectrometer met hoge resolutie in combinatie met een HPLC-systeem (LC-HRMS/MS-systeem). Werk aan de HPLC met een C18-kolom van 5 μm (100 x 2,10 mm), bij kamertemperatuur. Gebruik een gradiënt elutie met H2O (aangevuld met 0,1% HCOOH) en MeOHat 200 μL min-1. Het verloopprogramma is: 10% MeOH gedurende 3 min, 10% tot 100% MeOH gedurende 30 min, 100% MeOH voor 7 min. Gebruik MeOH als besturing. Gegevensverwerving. Verzamel gegevens in de data-afhankelijke acquisitiemodus (DDA): de 10 meest intensieve ionen van een full-scan massaspectrum moeten worden onderworpen aan een tandemmassaspectrometrie (HRMS/MS) met hoge resolutie. Verkrijg HRMS/MS-scans voor geselecteerde ionen met CID-fragmentatie, een isolatiebreedte van 2,0, genormaliseerde botsingsenergie van 35, activerings Q van 0,250 en een activeringstijd van 30 ms. Bio-informatische analyses en moleculaire netwerken Analyseer fragmentatiepatronen voor elk intens ion met behulp van MS-specifieke software. Gebruik MS-Cluster om de gegevens te clusteren (bovenliggende massatolerantie van 1,0 Da en MS/MS fragment ionentolerantie van 0,5 Da). Consensusspectra met minder dan 2 spectra worden geëlimineerd. Analyseer MS/MS-gegevens van GNPS (Global Natural Products Social36) voor moleculair netwerken. Vergelijk de consensusspectra en ook met die in de GNPS-Mass-Ive bibliotheken. Visualiseer het verkregen netwerk37.OPMERKING: Voor moleculair netwerken verwijzen wij u naar Sigrist et al. 202038. Figuur 3: FDS in-lab stappen (3-4). Visuele weergave van de belangrijkste activiteiten die na de bemonstering in het laboratorium worden uitgevoerd (stap 3 en 4). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Representative Results

In een eerste studie3werden in de zomer van 2015 vier antropogenisch getroffen locaties langs de kust van Campanië in SW Italië waargenomen met behulp van satelliet Landsat 8 en vliegtuigen. Landsat 8 operationele land imager sensor (OLI) en de vliegtuigen multispectrale camera toegestaan om normalized difference water index (NDWI) beelden te maken voor de gebieden, dus, om de aanwezigheid van cyanobacteriële gemeenschappen te onthullen. De samenstelling van de cyanobacteriële gemeenschap werd bepaald door middel van spectrofotometrische analyses voor de detectie van het cyanobacteriële pigmentfycocyanine (PC). Vervolgens maakte aanvullende 16S-metagenomische analyse het mogelijk om cyanobacteriële taxa te identificeren. De vereenvoudigde multispectrale beeldindexering en classificatie via satelliet/hoogwerkers in combinatie met metagenomische analyses waren effectief in het detecteren van de aanwezigheid van cyanobacteriën die behoren tot geslachten die geassocieerd zijn met sterke eutrofe aandoeningen (zoals Leptolyngbya sp., Pseudooscillatoria sp.), in een vroeg bloeistadium. In een tweede studie14werd de FDS-aanpak getest tijdens de lente/zomer van 2017. Satellietgegevens werden gebruikt als het enige teledetectieniveau. In detail maakten gegevens verkregen door MODerate Image Spectroradiometer (MODIS) sensor, gemonteerd op Terra en Aqua satellietplatforms, kwantificering van chlorofyl-a (Chl-a) in de waterlichamen langs de kusten van Campanië mogelijk en dreef de keuze uit tien bemonsteringsplekken. Monsters werden in het laboratorium verwerkt door microscopische observatie en taxonomische identificatie en vervolgens geëxtraheerd met organische oplosmiddelen. Organische extracten werden verwerkt door LC-MS-MS analyse. Gegevens verkregen door MS-MS werden geanalyseerd met behulp van een bio-informatische benadering, met behulp van het GNPS-platform om een netwerk van moleculen te creëren. Het netwerk werd geanalyseerd om toxines te detecteren en te identificeren die gegevens van de fragmentatiespectra verkregen door massaspectrometrie vergeleken met de GNPS-bibliotheek. Dit maakte het mogelijk om bekende toxines en onbekende analogen te detecteren die gerelateerd zullen lijken in hetzelfde moleculaire netwerk. In het bijzonder werd Lyngbyatoxine A, een lipofiel dermatotoxine, aangetroffen in alle watermonsters en tweekleppigenmonsters; in de moleculaire cluster Lyngbyatoxine A waren ook knooppunten aanwezig die geen verband hielden met bekende verbindingen van de lyngbyatoxinenfamilie, wat wijst op de aanwezigheid van onbekende lyngbyatoxine-analogen. Er werden geen microcystinen en andere toxines gedetecteerd in de monsters. Alle resultaten werden binnen 24 manuren verkregen. Figuur 4: Representatieve resultaten van FDS. Een voorbeeld van de toepassing van de FDS-strategie aan de kust van Campanië (Italië). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

In de afgelopen jaren heeft ons team verschillende benaderingen getest en gevalideerd die het mogelijk maakten om de aanwezigheid van cyanobacteriën en cyanotoxinen in waterlichamen en tweekleppigen te ontrafelen. De nieuwe ontwikkelde strategie is het resultaat van deze studies. De optimale technieken en technologieën die passen bij het bereik van snelle detectie, worden verzameld onder de hoed van een unieke procedure die de effectiviteit van elke stap maximaliseert. Het doelgebied, de bloeiverlenging en de groeifase zijn de drijvende kracht achter de keuze van geschikte methoden en technologieën om te gebruiken.

Wanneer snelle detectie van cyanobacteriën en cyanotoxinen de prioriteit is, wordt de strategie gestroomlijnd, waardoor het totale aantal wordt teruggebracht tot vier hoofdstappen: (1) Detectie op afstand en proximaal detecteren en gegevensanalyse voor een eerste onderzoek, lokalisatie van locaties en definitie van bloeipatroon en uitbreiding; (2) Begeleide bemonstering; (3) Microscopische observatie en taxonomische analyse; (4) Chemische analyse en moleculaire netwerkvorming van LC-MS-gegevens voor desreplicatie van de watermonsters en snelle detectie van cyanotoxinen.

Wat de eerste stap betreft, zelfs als de beschikbaarheid van gegevens die zijn verkregen door een volledige keten van platforms die alle lagen van hiërarchische monitoringbenadering bestrijken, de beste oplossing zou zijn om een volledige visie op het geanalyseerde scenario te herstellen, kan vaak slechts één informatielaag de gebiedsonderzoeksactie stimuleren en zich effectief concentreren op de hotspots om in-situ bemonsteringsacties uit te voeren. Volgens de gerapporteerde ervaringen waarbij gegevens werden verkregen met behulp van satellieten, vliegtuigen, helikopters, UAV’s, is de oplossing die volledig aansluit bij de behoeften die de snelle detectiestrategie vereist, het gebruik van de enige satellietproducten.

Bovendien herstellen de informatielagen die voortvloeien uit missies die worden uitgevoerd door platforms die op lagere hoogten vliegen dan satellieten (bijv. vliegtuigen, helikopters, UAV’s) informatie met een grote resolutie, maar deze zijn erg duur en vereisen ook meer tijd om het volledige acquisitieproces te voltooien, inclusief het definiëren en goedkeuren van het vluchtplan.

Zodra de te nemen monsters zijn geselecteerd (stap 2), zijn analytische/bioinformatica-analyses (Moleculaire netwerken van LC-MS-gegevens) het hulpmiddel voor snelle desreplicatie van de watermonsters en snelle detectie van cyanotoxinen (stappen 3 en 4). 16S metagenomic analyse duurt minstens 2 weken werk. Bovendien, zelfs wanneer cyanobacteriële soorten die generiek giftig zijn, worden geïdentificeerd, wordt hun toxineproductie niet aangetoond. Om dezelfde reden is microscopische observatie zelf niet voldoende om de aanwezigheid van giftige cyanobacteriën aan het licht te brengen. Natuurlijk hebben MS-analyse en moleculaire netwerken enkele beperkingen; ze zijn zeer effectief als de verbindingen van belang (bv. toxines) goed geïoniseerd zijn in de toegepaste omstandigheden, als ze voldoende zijn om te worden gedetecteerd. Voor de bekende detectie en monitoring van cyanobacteriële toxines vertegenwoordigt ms-gebaseerde moleculaire netwerken eigenlijk een van de robuustere en betrouwbaardere technologieën.

Daarom blijkt deze aanpak heel nuttig wanneer een snelle detectie van cyanobacteriën en verwante cyanotoxinen nodig is; bovendien is kwantificering van zowel cyanobacteriële bloei als toxine in de ruimte en tijd ook mogelijk door deze strategie om de problemen van gezondheidsgemeenschappen te voorkomen die kunnen ontstaan door grote cyanobacteriële toxische bloei.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit onderzoek werd gefinancierd door “Centro di Riferimento Regionale per la Sicurezza Sanitaria del Pescato (CRiSSaP)” in het kader van het project “Attività pilota di Monitoraggio di Cianobatteri nella fascia costiera della regione Campania”, en uitgevoerd in samenwerking met de Campania Region Environmental Protection Agency, Italië (ARPAC), “Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno/Osservatorio Regionale per la Sicurezza Alimentare” (IZSM/ORSA), Universiteit van Napels “Federico II” – Department of Veterinary Medicine and Animal Production, ref. prof. A. Anastasio).

Materials

10X Vitamin mix			Nicotinic acid 100 mg/100 mL; PABA 10 mg/100 mL; Biotin 1 mg/100 mL; Thiamine 200 mg/100 mL; B₁₂ 1 mg/100 mL; Folic Acid 1 mg/100 mL; i-inositol 1 mg/100 mL; Ca-pantothenate 100 mg/100 mL
1-BuOH	Sigma-Aldrich	33065.2.5L-R
BG11 stock solution			Na₂EDTA 20 mg/L; Ferric ammonium citrate 120 mg/L; Citric acid·1H₂O 120 mg/L; CaCl₂·2H₂O 700 mg/L, MgSO₄·7H₂O 1.5 g/L, K₂HPO₄·3H₂O 800 mg/L, NiSO₄(NH₄)2SO₄·6H₂O (0.1 mM stock) 5 mL; Na₂SeO₄ (0.1 mM stock) 2 mL, Nitsch's Solution 20 mL
Centrifuge	Hermle	Z36HK
CHCl₃	Honeywell	32211.2.5L
H₂O	Sigma-Aldrich	34877.2.5L
Kinetex C18 cloumn	Phenomenex
LTQ Orbitrap XL high-resolution ESI mass spectrometer coupled to a U3000 HPLC system	Thermo
MeOH	Honeywell	32213.2.5L
Microscope equipped with an OMAX 18 MP CMOS camera	Optech	Biostar B3
Multiband camera	Intergraph DMC
Nitsch's Solution			H₃BO₃0.5 g/L MnSO₄· H₂O 2.28 g/L ZnSO₄·7H₂O 0.5 g/L CuSO₄·5H₂O 0.025 g/L COCl₂·6H₂O 0.135 g/L Na₂MoO₄·2H₂O 0.025 g/L
Refractomer mr 100 ATC	AQL
SWBG11 medium			BG11 stock solution 50 mL/L; Instant Ocean 33 g/L; Water 950 mL/L 10X; Vitamin mix 100 µL/L

References

Tamele, I. J., Silva, M., Vasconcelos, V. The incidence of marine toxins and the associated seafood poisoning episodes in the African countries of the Indian ocean and the Red sea. Toxins. 11 (1), 25-48 (2019).
Lürling, M., Faassen, E. J. Dog poisonings associated with a Microcystis aeruginosa bloom in the Netherlands. Toxins. 5 (3), 556-567 (2013).
O’Neil, J. M., Davis, T. W., Burford, M. A., Gobler, C. J. The rise of harmful cyanobacteria blooms: The potential roles of eutrophication and climate change. Harmful Algae. 14, 313-334 (2012).
Teta, R., et al. Cyanobacteria as indicators of water quality in Campania coasts, Italy: A monitoring strategy combining remote/proximal sensing and in situ data. Environmental Research Letters. 12 (2), (2017).
Teta, R. Bioindicators as a tool in environmental impact assessment: Cyanobacteria as a sentinel of pollution. International Journal of Sustainable Development and Planning. 14 (1), 1-8 (2019).
Teta, R., Della Sala, G., Mangoni, A., Lega, M., Costantino, V. Tracing cyanobacterial blooms to assess the impact of wastewaters discharges on coastal areas and lakes. International Journal of Sustainable Development and Planning. 11 (5), 804-811 (2016).
Teta, R., et al. A joint molecular networking study of a: Smenospongia sponge and a cyanobacterial bloom revealed new antiproliferative chlorinated polyketides. Organic Chemistry Frontiers. 6 (11), 1762-1774 (2019).
Singh, R. K., Tiwari, S. P., Rai, A. K., Mohapatra, T. M. Cyanobacteria: an emerging source for drug discovery. Journal of Antibiotics. 64 (6), 401-412 (2011).
Huisman, J., et al. Cyanobacterial blooms. Nature Reviews Microbiology. 16 (8), 471-483 (2018).
Gupta, N., Pant, S. C., Vijayaraghavan, R., Rao, P. V. L. Comparative toxicity evaluation of cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin variants (LR, RR, YR) in mice. Toxicology. 188 (2-3), 285-296 (2003).
WHO. Cyanobacterial toxins: Microcystin-LR in drinking water. Background document for development of WHO Guidelines for Drinking-Water Quality. WHO. 2, (1998).
Agha, R., Cirés, S., Wörmer, L., Domínguez, J. A., Quesada, A. Multi-scale strategies for the monitoring of freshwater cyanobacteria: Reducing the sources of uncertainty. Water Research. 46 (9), 3043-3053 (2012).
Giménez-Campillo, C. Determination of cyanotoxins and phycotoxins in seawater and algae-based food supplements using ionic liquids and liquid chromatography with time-of-flight mass spectrometry. Toxins. 11 (10), 610 (2019).
Sanseverino, I., António, D. C., Loos, R., Lettieri, T. Cyanotoxins: methods and approaches for their analysis and detection. JRC Technical Reports. , (2017).
Teta, R. Combined LC-MS/MS and molecular networking approach reveals new cyanotoxins from the 2014 cyanobacterial bloom in Green Lake, Seattle. Environmental Science and Technology. 49 (24), 14301-14310 (2015).
Esposito, G., et al. A fast detection strategy for cyanobacterial blooms and associated cyanotoxins (FDSCC) reveals the occurrence of lyngbyatoxin A in campania (South Italy). Chemosphere. 225, 342-351 (2019).
Lega, M., Casazza, M., Teta, R., Zappa, C. J. Environmental impact assessment: a multilevel, multi-parametric framework for coastal waters. International Journal of Sustainable Development and Planning. 13 (8), 1041-1049 (2018).
Di Fiore, V. Integrated hierarchical geo-environmental survey strategy applied to the detection and investigation of an illegal landfill: A case study in the Campania Region (Southern Italy). Forensic Science International. 279, 96-105 (2017).
Gargiulo, F., Persechino, G., Lega, M., Errico, A. IDES project: A new effective tool for safety and security in the environment. Lecture Notes in Computer Science (including subseries Lecture Notes in Artificial Intelligence and Lecture Notes in Bioinformatics). , (2013).
Ferrara, C., Lega, M., Fusco, G., Bishop, P., Endreny, T. Characterization of terrestrial discharges into coastal waters with thermal imagery from a hierarchical monitoring program. Water. 9 (7), (2017).
Alfeo, A. L., Cimino, M. G. C. A., De Francesco, N., Lega, M., Vaglini, G. Design and simulation of the emergent behavior of small drones swarming for distributed target localization. Journal of Computational Science. 29, 19-33 (2018).
Casazza, M., Lega, M., Liu, G., Ulgiati, S., Endreny, T. A. Aerosol pollution, including eroded soils, intensifies cloud growth, precipitation, and soil erosion: a review. Journal of Cleaner Production. 189, 135-144 (2018).
. U.S. Geological Survey Available from: https://ers.cr.usgs.gov (2020)
. NASA Earthdata Available from: https://urs.earthdata.nasa.gov (2020)
. Copernicus Opern Access Hub Available from: https://scihub.copernicus.eu/apihub (2020)
Chen, H. -. H., Tang, R., Zhang, H. -. R., Yu, Y., Wang, Y. Investigating the relationship between sea surface chlorophyll and major features of the south china sea with satellite information. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), (2020).
. QGIS Available from: https://www.qgis.org/it/site/ (2020)
. Semi-automatic classification plugin documentation release 4.8.0.1 Available from: https://manualzz.com/doc/7130012/semi-automatic-classification-plugin-documentation (2016)
Rouse, J. W., Hass, R. H., Schell, J. A., Deering, D. W. Monitoring vegetation systems in the great plains with ERTS. Third Earth Resources Technology Satellite (ERTS) Symposium. 1, 309-317 (1973).
Carmona, F., Rivas, R., Fonnegra, D. C. Vegetation index to estimate chlorophyll content from multispectral remote sensing data. European Journal of Remote Sensing. 48 (1), 319-326 (2015).
Savtchenko, A., et al. MODIS data from terra and aqua satellites. International Geoscience and Remote Sensing Symposium (IGARSS). 5, 3028-3030 (2003).
Binding, C. E., Greenberg, T. A., McCullough, G., Watson, S. B., Page, E. An analysis of satellite-derived chlorophyll and algal bloom indices on Lake Winnipeg. Journal of Great Lakes Research. 44 (3), 436-446 (2018).
Komárek, J., Kaštovský, J., Mareš, J., Johansen, J. R. Taxonomic classification of cyanoprokaryotes (cyanobacterial genera) 2014, using a polyphasic approach. Preslia. 86, 295-335 (2014).
Esposito, G., et al. Chlorinated thiazole-containing polyketide-peptides from the caribbean sponge smenospongia conulosa: structure elucidation on microgram scale. European Journal of Organic Chemistry. 2016 (16), 2871-2875 (2016).
Shannon, P. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Research. 13 (11), 2498-2504 (2003).
Sigrist, R., Paulo, B. S., Angolini, C. F. F., De Oliveira, L. G. Mass spectrometry-guided genome mining as a tool to uncover novel natural products. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Teta, R., Esposito, G., De Sterlich, C., Lega, M., Costantino, V. Early Detection of Cyanobacterial Blooms and Associated Cyanotoxins using Fast Detection Strategy. J. Vis. Exp. (168), e61889, doi:10.3791/61889 (2021).

Automatically Generated