Inserimento co-traduzionale di proteine di membrana in nanodischi preformati

Le proteine di membrana (MP) sono obiettivi impegnativi negli studi sulla produzione di proteine a causa della loro insolubilità in ambienti acquosi. Le piattaforme di produzione MP convenzionali comprendono sistemi basati su cellule come E. coli, lievito o cellule eucariotiche. Gli MP ricombinanti sintetizzati vengono estratti dalle membrane cellulari o ripiegati dai corpi di inclusione¹. Dopo la solubilizzazione del detergente, gli MP possono essere trasferiti in ambienti di membrana adatti mediante protocolli di ricostituzione in vitro stabiliti. Oltre alle vescicole e ai liposomi, la ricostituzione di MP nelle membrane planari sotto forma di nanodischi² o particelle salipro³ è diventata una tecnica di routine negli ultimi tempi. Tuttavia, tutte queste strategie implicano il contatto del detergente con i MP che può provocare destabilizzazione, dissociazione degli oligomeri e persino perdita della struttura e dell’attività proteica⁴. Lo screening per condizioni ottimali di solubilizzazione e ricostituzione del detergente può quindi essere noioso e richiedere molto tempo⁵.

La natura aperta dei sistemi cell-free (CF) consente di fornire direttamente la reazione di espressione con membrane preformate con una composizione lipidica definita. In questa modalità di espressione a base lipidica (L-CF), i MP sintetizzati hanno l’opportunità di inserire co-traduzionalmente nei doppi strati forniti ^6,7 (Figura 1). I nanodischi costituiti da una proteina di scaffold di membrana (MSP) che circonda un disco planare lipidico a doppio strato⁸ sembrano essere particolarmente adatti per questa strategia ^9,10. I nanodischi possono essere assemblati di routine in vitro con una varietà di lipidi diversi, sono molto stabili e le scorte possono essere concentrate fino a 1 mM. Tuttavia, l’espressione della MSP in E. coli e la sua purificazione sono necessarie. Come strategia alternativa, la MSP può essere co-espressa insieme al target MP nelle reazioni CF fornite con liposomi^11,12,13. I modelli di DNA sia per MSP che MP vengono aggiunti nella reazione e MP/nanodischi possono formarsi durante l’espressione. Mentre la produzione di MSP è evitata, la strategia di co-espressione richiede un’attenta messa a punto delle concentrazioni finali del modello di DNA e ci si possono aspettare variazioni più elevate nell’efficienza della produzione del campione.

L’inserimento co-traduzionale di MP in membrane di nanodischi preformati è un meccanismo non fisiologico e ancora in gran parte sconosciuto indipendente dai macchinari translocon e dalle sequenze di segnale^13,14,15,16. I principali determinanti dell’efficienza di inserzione sono il tipo di proteina di membrana e la composizione lipidica della membrana fornita, con una frequente preferenza per i lipidi caricati negativamente^15,17. Poiché le membrane dei nanodischi sono di dimensioni relativamente limitate, una notevole quantità di lipidi viene rilasciata dopo l’inserimento MP¹⁸. La variazione della dimensione del nanodisco consente l’inserimento e la messa a punto di complessi MP oligomerici superiori^15,18. Tra gli altri, è stato dimostrato il corretto assemblaggio di complessi omooligomerici per il canale ionico KcsA, per la pompa ionica proteorodopsina (PR) e per il trasportatore multifarmaco EmrE^15,18. È probabile che gli MP entrino nella membrana simmetrica del nanodisco da entrambi i lati con una frequenza relativamente uguale. Va pertanto considerato che diversi monomeri o oligomeri inseriti in un nanodisco possono avere orientamenti opposti. Tuttavia, un bias nell’orientamento potrebbe essere causato da meccanismi di inserzione cooperativa come riportato per la formazione di esameri PR e tetrameri KcsA¹⁸. Un’ulteriore distorsione nell’orientamento MP potrebbe derivare da interruttori di orientamento di MP inseriti probabilmente sul bordo delle membrane del nanodisco.

La produzione di lisati CF da ceppi di E. coli è una tecnica di routine affidabile e può essere eseguita in quasi tutti i laboratori biochimici^19,20. Va considerato che, oltre alla formazione di ponti disolfuro, la maggior parte delle altre modifiche post-traduzionali sono assenti se un MP viene sintetizzato usando lisati di E. coli. Sebbene ciò possa generare campioni più omogenei per gli studi strutturali, potrebbe essere necessario escludere potenziali effetti sulla funzione dei singoli bersagli MP. Tuttavia, la produzione efficiente di campioni di alta qualità di recettori accoppiati a proteine G (GPCR)14,21,22^, trasportatori eucariotici 23 o grandi gruppi eteromerici ²⁴ in lisati CF di E. coli indica la loro idoneità anche per bersagli complessi. Le quantità su scala preparativa (≈ 1 mg/ml) di un campione possono essere ottenute con la configurazione senza cella a scambio continuo a due compartimenti (CECF), composta da un compartimento di una miscela di reazione (RM) e da un compartimento di miscela di alimentazione (FM). Il volume FM supera il volume RM da 15 a 20 volte e fornisce un serbatoio di composti energetici a basso peso molecolare e precursori¹⁹. La reazione di espressione viene così estesa per diverse ore e la resa finale del target MP viene aumentata. I compartimenti RM e FM sono separati da una membrana di dialisi con un cutoff di 10-14 kDa. I due compartimenti richiedono un design speciale del contenitore di reazione CECF (Figura 1). Le cassette di dialisi commerciali come contenitori RM in combinazione con contenitori in plexiglass su misura contenenti il FM sono esempi adatti. Le rese MP possono essere ulteriormente manipolate modificando i rapporti RM:FM o scambiando l’FM dopo un certo periodo di incubazione.

La resa e la qualità di un MP richiedono spesso un’intensa ottimizzazione dei parametri di reazione. Un importante vantaggio dell’espressione CF è la possibilità di modificare e mettere a punto quasi tutti i composti in base alle esigenze individuali di un MP. Una strategia semplice consiste nel concentrarsi prima sul miglioramento della resa di un MP stabilendo un protocollo di produzione di base e quindi sull’ottimizzazione della qualità MP regolando le condizioni di reazione e piegatura. L’assenza di processi fisiologici nei lisati CF e la loro ridotta complessità si traducono in alti tassi di successo per la produzione efficiente di MP²⁵. Le considerazioni di routine per la progettazione del modello di DNA e l’ottimizzazione della concentrazione di ioni Mg 2⁺ sono nella maggior parte dei casi sufficienti per ottenere rendimenti soddisfacenti²⁶. A seconda della modalità di espressione, l’ottimizzazione della qualità MP può richiedere molto tempo, poiché è necessario esaminare una maggiore varietà di parametri^14,17,22.

Per stabilire la piattaforma di espressione CF descritta, sono necessari protocolli per la produzione di E. coli CF lisato (i), T7 RNA polimerasi (ii), nanodischi (iii) e composti di reazione CECF di base (iv) (Figura 1). I derivati di E. coli K12 ceppo A19²⁷ o BL21 sono frequentemente utilizzati per la preparazione di lisati efficienti S30 (centrifugazione a 30.000 x g). Oltre ai lisati S30, possono essere utilizzati lisati corrispondenti centrifugati ad altre forze g (ad esempio S12). I lisati differiscono nell’efficienza di espressione e nella complessità del proteoma. Il proteoma del lisato S30 preparato dal protocollo descritto è stato studiato in dettaglio²⁸. Il proteoma S30 contiene ancora alcune proteine residue della membrana esterna che potrebbero dare problemi di fondo durante l’espressione e l’analisi dei canali ionici. Per tali obiettivi, si raccomanda l’uso di lisati S80-S100. Una preziosa modifica durante la preparazione del lisato è l’induzione della risposta SOS mediante shock termico combinato e fornitura di etanolo nella fase di crescita intermedia delle cellule. I lisati HS30 risultanti sono arricchiti in chaperoni e possono essere utilizzati in miscele con lisati S30 per migliorare il ripiegamento MP²². L’espressione di CF in lisati di E. coli è operata come un processo di trascrizione/traduzione accoppiato con modelli di DNA contenenti promotori controllati dalla T7 RNA polimerasi (T7RNAP). L’enzima può essere prodotto in modo efficiente nelle cellule stellari BL21(DE3) che trasportano il plasmide 29 pAR1219.

Due copie di MSP1E3D1 si assemblano in un nanodisco con un diametro di 10-12 nm, ma il protocollo descritto di seguito può funzionare anche per altri derivati MSP. Tuttavia, i nanodischi più grandi di quelli formati con MSP1E3D1 tendono ad essere meno stabili, mentre i nanodischi più piccoli formati con derivati MSP come MSP1 potrebbero non ospitare MP o complessi MP più grandi. I nanodischi MSP1E3D1 possono essere assemblati in vitro con una grande varietà di lipidi o miscele lipidiche diverse. I nanodischi preformati sono generalmente stabili per > 1 anno a -80 °C, mentre la stabilità può variare per diversi componenti lipidici. Per lo screening degli effetti lipidici sul ripiegamento e sulla stabilità di un MP, è necessario preparare un set completo di nanodischi assemblati con una varietà rappresentativa di miscele lipidiche / lipidiche. I seguenti lipidi possono dare una buona selezione di partenza: 1,2-Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfo-(1′-rac-glicerolo) (DMPG), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), 1,2 dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-rac-(1-glicerolo) (DOPG), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1′-rac-glicerolo) (POPG) e 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC).

Viene descritto un protocollo per la preparazione di una reazione CECF da 3 ml. È possibile un ulteriore ridimensionamento verso l’alto o verso il basso in un rapporto 1:1. Per la configurazione CECF a due compartimenti, devono essere preparati un RM contenente tutti i composti e un FM contenente solo i composti a basso peso molecolare. I dispositivi commerciali per dialisi da 3 mL con MWCO da 10-14 kDa possono essere utilizzati come contenitori RM, che vengono poi collocati in contenitori in plexiglass personalizzati contenenti FM (Figura 1D)³⁰. Il rapporto RM:FM è 1:20, quindi 60 mL di FM devono essere preparati per 3 mL RM. La qualità, la concentrazione o il tipo di diversi componenti possono essere critici per la resa finale e/o la qualità del MP sintetizzato (Tabella 1). I modelli di DNA devono essere preparati secondo le linee guida pubblicate e l’ottimizzazione del codone del frame di lettura del bersaglio può migliorare ulteriormente significativamente la resa del prodotto²⁶. Per la reazione CECF su scala preparativa, viene descritto un protocollo stabilito per la produzione di PR. Per stabilire protocolli di espressione per i nuovi MP, di solito è necessario eseguire schermate di ottimizzazione di alcuni composti (Tabella 1) per migliorare la resa e la qualità. Per gli ioni Mg²⁺ , esiste un ottimale di concentrazione ben focalizzato che spesso mostra variazioni significative per diversi modelli di DNA. Altri composti di reazione CF come nuovi lotti di lisati T7RNAP o S30 possono spostare ulteriormente la concentrazione ottimale di Mg²⁺ . Ad esempio, viene descritto un tipico schermo Mg 2+ nell’intervallo di concentrazione di^14-24 mM e in incrementi di 2 mM. Ogni concentrazione viene sottoposta a screening in duplicati e in reazioni CECF su scala analitica. Come contenitore di reazione CECF, i contenitori in plexiglas Mini-CECF su misura³⁰ che contengono l’RM vengono utilizzati in combinazione con micropiastre standard a 24 pozzetti che contengono l’FM (Figura 1B). In alternativa, possono essere utilizzate cartucce per dialisi commerciali in combinazione con micropiastre a pozzetti profondi 96 o altri dispositivi dializzatori commerciali in configurazioni appropriate (Figura 1C).