Inserção Co-Translacional de Proteínas de Membrana em Nanodiscos Pré-Formados

As proteínas de membrana (MPs) são alvos desafiadores em estudos de produção de proteínas devido à sua insolubilidade em ambientes aquosos. As plataformas convencionais de produção de MP compreendem sistemas baseados em células, como E. coli, levedura ou células eucarióticas. As MPs recombinantes sintetizadas são extraídas das membranas celulares ou redobradas dos corpos de inclusão¹. Após a solubilização do detergente, os MPs podem ser transferidos para ambientes de membrana adequados por protocolos de reconstituição in vitro estabelecidos. Além de vesículas e lipossomas, a reconstituição de MP em membranas planares na forma de nanodiscos² ou partículas de salipro³ tornaram-se técnicas rotineiras nos últimos tempos. No entanto, todas essas estratégias implicam o contato detergente com MPs que pode resultar em desestabilização, dissociação de oligômeros e até mesmo perda de estrutura e atividade proteica⁴. A triagem para condições ideais de solubilização e reconstituição de detergentes pode, portanto, ser tediosa e demorada⁵.

A natureza aberta dos sistemas livres de células (FC) permite que a reação de expressão seja diretamente fornecida com membranas pré-formadas com uma composição lipídica definida. Nesse modo de expressão à base de lipídios (L-CF), os MPs sintetizados têm a oportunidade de inserir co-translacionalmente nas bicamadas fornecidas ^6,7 (Figura 1). Nanodiscos constituídos por uma proteína de andaime de membrana (MSP) em torno de um disco planar de bicamada lipídica⁸ parecem ser particularmente adequados para essa estratégia ^9,10. Os nanodiscos podem ser rotineiramente montados in vitro com uma variedade de lipídios diferentes, são muito estáveis e os estoques podem ser concentrados até 1 mM. No entanto, a expressão de MSP em E. coli e sua purificação são necessárias. Como estratégia alternativa, a MSP pode ser coexpressa em conjunto com a MP alvo em reações de FC fornecidas com lipossomas^11,12,13. Modelos de DNA para MSP e MP são adicionados à reação e MP / nanodiscos podem se formar após a expressão. Embora a produção de MSP seja evitada, a estratégia de co-expressão requer um ajuste fino cuidadoso das concentrações finais do molde de DNA e maiores variações na eficiência da produção de amostras podem ser esperadas.

A inserção co-translacional de MPs em membranas de nanodiscos pré-formados é um mecanismo não fisiológico e ainda amplamente desconhecido, independente de máquinas de translocon e sequências de sinais^13,14,15,16. Os principais determinantes da eficiência de inserção são o tipo de proteína de membrana, bem como a composição lipídica da membrana fornecida, com preferência frequente por lipídios carregados negativamente^15,17. Como as membranas dos nanodiscos são relativamente confinadas em tamanho, uma quantidade substancial de lipídios é liberada após a inserção do MP¹⁸. A variação do tamanho do nanodisco permite a inserção e o ajuste de complexos de MP oligoméricos superiores^15,18. Entre outros, a montagem correta de complexos homooligoméricos foi mostrada para o canal iônico KcsA, para a bomba iônica proteorhodopsina (PR) e para o transportador multifármaco EmrE^15,18. É provável que os MPs entrem na membrana simétrica do nanodisco de ambos os lados em frequência relativamente igual. Por conseguinte, deve considerar-se que diferentes monómeros ou oligômeros inseridos em um nanodisco podem ter orientações opostas. No entanto, um viés na orientação pode ser causado por mecanismos de inserção cooperativa, conforme relatado para a formação de hexâmeros PR e tetrâmeros KcsA¹⁸. Um viés adicional na orientação do MP pode resultar de interruptores de orientação de MPs inseridos provavelmente na borda das membranas de nanodisco.

A produção de lisados de FC a partir de cepas de E. coli é uma técnica de rotina confiável e pode ser realizada em praticamente qualquer laboratório bioquímico^19,20. Deve-se considerar que, além da formação de pontes dissulfeto, a maioria das outras modificações pós-translacionais está ausente se um MP for sintetizado usando lisatos de E. coli. Embora isso possa gerar amostras mais homogêneas para estudos estruturais, pode ser necessário excluir efeitos potenciais sobre a função de alvos individuais de MP. No entanto, a produção eficiente de amostras de alta qualidade de receptores acoplados à proteína G (GPCR)14,21,22^, transportadores eucarióticos 23 ou grandes conjuntos heteroméricos ²⁴ em lisados de E. coli CF indica sua adequação até mesmo para alvos complexos. As quantidades de escala preparativa (≈ 1 mg/mL) de uma amostra podem ser obtidas com a configuração livre de células de troca contínua de dois compartimentos (CECF), composta por uma mistura de reação (RM) e um compartimento de mistura alimentar (FM). O volume de FM excede o volume RM de 15 a 20 vezes e fornece um reservatório de compostos e precursores de energia de baixo peso molecular¹⁹. A reação de expressão é, portanto, estendida por várias horas e o rendimento final do alvo MP é aumentado. Os compartimentos RM e FM são separados por uma membrana de diálise com um ponto de corte de 10-14 kDa. Os dois compartimentos requerem um projeto especial do recipiente de reação do CECF (Figura 1). de diálise comerciais como recipientes RM em combinação com recipientes de plexiglass sob medida que seguram o FM são exemplos adequados. Os rendimentos de MP podem ainda ser manipulados modificando as relações RM:FM ou trocando o FM após um certo período de incubação.

O rendimento e a qualidade de um MP frequentemente exigem intensa otimização dos parâmetros de reação. Uma vantagem importante da expressão da FC é a possibilidade de modificar e ajustar quase qualquer composto de acordo com os requisitos individuais de um MP. Uma estratégia simples é concentrar-se primeiro em melhorar o rendimento de um MP, estabelecendo um protocolo básico de produção e, em seguida, otimizar a qualidade do MP ajustando as condições de reação e dobramento. A ausência de processos fisiológicos nos lisados da FC e sua reduzida complexidade resultam em altas taxas de sucesso para a produção eficiente de MPs²⁵. Considerações de rotina para o desenho do molde de DNA e otimização da concentração de íons Mg 2⁺ são, na maioria dos casos, suficientes para a obtenção de rendimentos satisfatórios²⁶. Dependendo do modo de expressão, a otimização da qualidade do MP pode se tornar demorada, pois uma maior variedade de parâmetros precisa ser rastreada^14,17,22.

Para estabelecer a plataforma de expressão de FC descrita, são necessários protocolos para a produção de lisado de E. coli CF (i), RNA polimerase T7 (ii), nanodiscos (iii) e os compostos básicos de reação do CECF (iv) (Figura 1). Os derivados A19^{27 ou BL21} da cepa de E. coli K12 são frequentemente utilizados para a preparação de lisatos eficientes de S30 (centrifugação a 30.000 x g). Além dos lisatos S30, os lisados correspondentes centrifugados em outras forças-g (por exemplo, S12) podem ser usados. Os lisados diferem na eficiência da expressão e na complexidade do proteoma. O proteoma do lisado S30 preparado pelo protocolo descrito tem sido estudado em detalhes²⁸. O proteoma S30 ainda contém algumas proteínas residuais da membrana externa que podem causar problemas de fundo na expressão e análise dos canais iônicos. Para tais alvos, recomenda-se o uso de lisados S80-S100. Uma modificação valiosa durante a preparação do lisado é a indução da resposta SOS por choque térmico combinado e fornecimento de etanol na fase de crescimento do tronco médio das células. Os lisados HS30 resultantes são enriquecidos em chaperonas e podem ser usados em misturas com lisados S30 para melhorar a dobragem MP²². A expressão de FC em lisados de E. coli é operada como um processo de transcrição/tradução acoplado com moldes de DNA contendo promotores controlados pela RNA polimerase T7 (T7RNAP). A enzima pode ser eficientemente produzida em células estelares BL21(DE3) que transportam o plasmídeo pAR1219²⁹.

Duas cópias do MSP1E3D1 se reúnem em um nanodisco com um diâmetro de 10-12 nm, mas o protocolo descrito abaixo também pode funcionar para outros derivados do MSP. No entanto, nanodiscos maiores do que aqueles formados com MSP1E3D1 tendem a ser menos estáveis, enquanto nanodiscos menores formados com derivados de MSP, como MSP1, podem não acomodar MPs maiores ou complexos de MP. Os nanodiscos MSP1E3D1 podem ser montados in vitro com uma grande variedade de diferentes lipídios ou misturas lipídicas. Os nanodiscos pré-formados são geralmente estáveis por > 1 ano a -80 °C, enquanto a estabilidade pode variar para diferentes componentes lipídicos. Para a triagem dos efeitos lipídicos no dobramento e estabilidade de um MP, é necessário preparar um conjunto abrangente de nanodiscos montados com uma variedade representativa de lipídios/misturas lipídicas. Os seguintes lipídios podem dar uma boa seleção inicial: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) (DMPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (DOPG), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) (POPG) e 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC).

Um protocolo para a preparação de uma reação de 3 mL de CECF é descrito. É possível aumentar ou diminuir ainda mais a escala em uma proporção de 1:1. Para a configuração do CECF de dois compartimentos, deve ser preparado um RM contendo todos os compostos e um FM contendo apenas os compostos de baixo peso molecular. Dispositivos comerciais de diálise de 3 mL com MWCO de 10-14 kDa podem ser usados como recipientes RM, que são então colocados em recipientes de plexiglass feitos sob medida que seguram o FM (Figura 1D)³⁰. A proporção de RM:FM é de 1:20, de modo que 60 mL de FM devem ser preparados para 3 mL RM. Qualidade, concentração ou tipo de vários componentes podem ser críticos para o rendimento final e/ou qualidade do MP sintetizado (Tabela 1). Os modelos de DNA devem ser preparados de acordo com as diretrizes publicadas e a otimização do códon do quadro de leitura do alvo pode melhorar significativamente o rendimento do produto²⁶. Para a reação do CECF em escala preparativa, descreve-se um protocolo estabelecido para a produção de RP. Para estabelecer protocolos de expressão para novos MPs, geralmente é necessário realizar telas de otimização de determinados compostos (Tabela 1) para melhorar o rendimento e a qualidade. Para íons Mg²⁺ , existe uma concentração ótima bem focada que frequentemente mostra variação significativa para diferentes modelos de DNA. Outros compostos de reação da FC, como novos lotes de lisados T7RNAP ou S30, podem alterar ainda mais a concentração ideal^{de Mg 2} +. Como exemplo, uma tela típica de Mg 2+ dentro da faixa de concentração de^14-24 mM e em etapas de 2 mM é descrita. Cada concentração é rastreada em duplicatas e em reacções do CECF à escala analítica. Como recipiente de reação CECF, os recipientes de plexiglas Mini-CECF³⁰ feitos sob medida que contêm o RM são usados em combinação com microplacas padrão de 24 poços que seguram o FM (Figura 1B). Alternativamente, cartuchos de diálise comerciais em combinação com microplacas de poço de 96 profundidades ou outros dispositivos dialisadores comerciais em configurações apropriadas podem ser usados (Figura 1C).