Co-translationale Insertion von Membranproteinen in vorgeformte Nanoscheiben

Membranproteine (MPs) sind aufgrund ihrer Unlöslichkeit in wässrigen Umgebungen anspruchsvolle Ziele in Proteinproduktionsstudien. Herkömmliche MP-Produktionsplattformen umfassen zellbasierte Systeme wie E. coli, Hefe oder eukaryotische Zellen. Die synthetisierten rekombinanten MPs werden entweder aus Zellmembranen extrahiert oder aus Einschlusskörpern refoldet¹. Nach der Detergensolubilisierung können MPs durch etablierte In-vitro-Rekonstitutionsprotokolle in geeignete Membranumgebungen überführt werden. Neben Vesikeln und Liposomen ist die MP-Rekonstitution in planare Membranen in Form von Nanodiscs² – oder^{Salipro-3-Partikeln} in jüngster Zeit zur Routine geworden. Alle diese Strategien implizieren jedoch einen Waschmittelkontakt mit MPs, der zu Destabilisierung, Dissoziation von Oligomeren und sogar zum Verlust der Proteinstruktur und -aktivität führen kann⁴. Das Screening auf optimale Reinigungsmittel-Solubilisierungs- und Rekonstitutionsbedingungen kann daher mühsam und zeitaufwendig sein⁵.

Die Offenheit zellfreier (CF) Systeme ermöglicht es, die Expressionsreaktion direkt mit vorgeformten Membranen mit definierter Lipidzusammensetzung zu versorgen. In diesem lipidbasierten Expressionsmodus (L-CF) haben die synthetisierten MPs die Möglichkeit, co-translational in die bereitgestellten Doppelschichten ^6,7 einzufügen (Abbildung 1). Nanoscheiben, die aus einem Membrangerüstprotein (MSP) bestehen, das eine planare Lipiddoppelschichtscheibe⁸ umgibt, scheinen für diese Strategie ^9,10 besonders geeignet zu sein. Nanoscheiben können routinemäßig in vitro mit einer Vielzahl verschiedener Lipide zusammengesetzt werden, sie sind sehr stabil und die Bestände können bis zu 1 mM konzentriert werden. Die MSP-Expression in E. coli und ihre Reinigung ist jedoch notwendig. Als alternative Strategie kann MSP zusammen mit dem Ziel-MP in CF-Reaktionen exprimiert werden, die mit Liposomen^11,12,13 versorgt werden. DNA-Templates für MSP und MP werden der Reaktion hinzugefügt und MP / Nanodiscs können sich bei der Expression bilden. Während die MSP-Produktion vermieden wird, erfordert die Co-Expressionsstrategie eine sorgfältige Feinabstimmung der endgültigen DNA-Template-Konzentrationen, und höhere Schwankungen in der Effizienz der Probenproduktion sind zu erwarten.

Das co-translationale Einfügen von MPs in Membranen vorgeformter Nanoscheiben ist ein unphysiologischer und noch weitgehend unbekannter Mechanismus, der unabhängig von Translokationsmaschinen und Signalsequenzen^13,14,15,16 ist. Hauptdeterminanten der Insertionseffizienz sind die Art des Membranproteins sowie die Lipidzusammensetzung der bereitgestellten Membran, wobei häufig negativ geladene Lipide^{bevorzugt werden 15,17}. Da die Nanoscheibenmembranen relativ begrenzt sind, wird bei MP-Insertion¹⁸ eine beträchtliche Menge an Lipiden freigesetzt. Die Variation der Nanoscheibengröße ermöglicht das Einfügen und Einstellen von höheren oligomeren MP-Komplexen^15,18. Unter anderem wurde der korrekte Aufbau homooligomerer Komplexe für den Ionenkanal KcsA, für die Ionenpumpe Proteorhodopsin (PR) und für den Multidrug-Transporter EmrE^15,18 gezeigt. MPs werden wahrscheinlich von beiden Seiten mit relativ gleicher Frequenz in die symmetrische Nanoscheibenmembran eindringen. Es sollte daher berücksichtigt werden, dass verschiedene Monomere oder Oligomere, die in eine Nanoscheibe eingefügt werden, entgegengesetzte Orientierungen aufweisen können. Eine Verzerrung der Orientierung könnte jedoch durch kooperative Insertionsmechanismen verursacht werden, wie sie für die Bildung von PR-Hexamern und KcsA-Tetrameren berichtet^{wurden 18}. Eine weitere Verzerrung in der MP-Orientierung könnte sich aus Orientierungsschaltern von eingefügten MPs ergeben, wahrscheinlich am Rand der Nanoscheibenmembranen.

Die Herstellung von CF-Lysaten aus E. coli-Stämmen ist eine zuverlässige Routinetechnik und kann in fast jedem biochemischen Labor durchgeführt werden^19,20. Es sollte berücksichtigt werden, dass neben der Disulfidbrückenbildung die meisten anderen posttranslationalen Modifikationen fehlen, wenn ein MP mit E. coli-Lysaten synthetisiert wird. Während dies homogenere Stichproben für Strukturstudien erzeugen könnte, kann es notwendig sein, mögliche Auswirkungen auf die Funktion einzelner MP-Ziele auszuschließen. Die effiziente Herstellung von qualitativ hochwertigen Proben von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR)14,21,22^, eukaryotischen Transportern²³ oder großen heteromeren Anordnungen ²⁴ in E. coli-CF-Lysaten zeigt jedoch deren Eignung auch für komplexe Targets. Präparative Skalenmengen (≈ 1 mg/ml) einer Probe können mit der CECF-Konfiguration (Continuous Exchange Cell-Free) mit zwei Kompartimenten erhalten werden, die aus einem Reaktionsgemisch (RM) und einem Fütterungsgemisch (FM) besteht. Das FM-Volumen übersteigt das RM-Volumen um das 15- bis 20-fache und bietet ein Reservoir an niedermolekularen Energieverbindungen und Vorläufern¹⁹. Die Expressionsreaktion wird somit um mehrere Stunden verlängert und die Endausbeute des MP-Targets erhöht. Die RM- und FM-Fächer sind durch eine Dialysemembran mit einem Cutoff von 10-14 kDa getrennt. Die beiden Kompartimente erfordern ein spezielles Design des CECF-Reaktionsbehälters (Abbildung 1). Kommerzielle Dialysekassetten als RM-Container in Kombination mit maßgeschneiderten Plexiglasbehältern mit dem FM sind geeignete Beispiele. MP-Ausbeuten können weiter manipuliert werden, indem das RM:FM-Verhältnis geändert oder das FM nach einer bestimmten Inkubationszeit ausgetauscht wird.

Ausbeute und Qualität eines MP erfordern häufig eine intensive Optimierung der Reaktionsparameter. Ein wichtiger Vorteil der CF-Expression ist die Möglichkeit, nahezu jede Verbindung nach den individuellen Anforderungen eines MP zu modifizieren und zu feinabstimmen. Eine einfache Strategie besteht darin, sich zunächst auf die Verbesserung der Ausbeute eines MP zu konzentrieren, indem ein grundlegendes Produktionsprotokoll erstellt wird, und dann die MP-Qualität durch Feinabstimmung der Reaktions- und Faltbedingungen zu optimieren. Das Fehlen physiologischer Prozesse in CF-Lysaten und deren reduzierte Komplexität führen zu hohen Erfolgsraten für die effiziente Herstellung von MPs²⁵. Routineüberlegungen für das Design von DNA-Templates und die Optimierung der^Mg2+-Ionenkonzentration reichen in den meisten Fällen aus, um zufriedenstellende Ausbeuten zu erzielen²⁶. Je nach Ausdrucksmodus kann die Optimierung der MP-Qualität zeitaufwändig werden, da eine größere Vielfalt von Parametern gescreent werden muss^14,17,22.

Um die beschriebene CF-Expressionsplattform zu etablieren, sind Protokolle für die Herstellung von E. coli-CF-Lysat (i), T7-RNA-Polymerase (ii), Nanodiscs (iii) und den grundlegenden CECF-Reaktionsverbindungen (iv) erforderlich (Abbildung 1). Die E. coli K12 Stamm A19²⁷ oder BL21 Derivate werden häufig zur Herstellung von effizienten S30 (Zentrifugation bei 30.000 x g) Lysaten verwendet. Neben S30-Lysaten können entsprechende Lysate verwendet werden, die bei anderen g-Kräften (z.B. S12) zentrifugiert wurden. Die Lysate unterscheiden sich in der Expressionseffizienz und in der Proteomkomplexität. Das Proteom des nach dem beschriebenen Protokoll hergestellten S30-Lysats wurde eingehend^{untersucht 28}. Das S30-Proteom enthält noch einige restliche äußere Membranproteine, die Hintergrundprobleme bei der Expression und Analyse von Ionenkanälen verursachen könnten. Für solche Ziele wird die Verwendung von S80-S100-Lysaten empfohlen. Eine wertvolle Modifikation während der Lysataufbereitung ist die Induktion der SOS-Antwort durch kombinierte Hitzeschock- und Ethanolzufuhr in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase der Zellen. Die resultierenden HS30-Lysate sind mit Chaperonen angereichert und können in Mischungen mit S30-Lysaten für eine verbesserte MP-Faltung^{verwendet werden 22}. Die CF-Expression in E. coli-Lysaten wird als gekoppelter Transkriptions-/Translationsprozess mit DNA-Templates betrieben, die Promotoren enthalten, die von der T7-RNA-Polymerase (T7RNAP) kontrolliert werden . Das Enzym kann effizient in BL21(DE3)-Sternzellen hergestellt werden, die das pAR1219-Plasmid²⁹ tragen.

Zwei Kopien von MSP1E3D1 fügen sich zu einer Nanoscheibe mit einem Durchmesser von 10-12 nm zusammen, aber das unten beschriebene Protokoll kann auch für andere MSP-Derivate funktionieren. Nanoscheiben, die größer sind als die mit MSP1E3D1 gebildeten, sind jedoch tendenziell weniger stabil, während kleinere Nanoscheiben, die mit MSP-Derivaten wie MSP1 gebildet werden, möglicherweise keine größeren MPs oder MP-Komplexe aufnehmen. MSP1E3D1-Nanoscheiben können in vitro mit einer Vielzahl unterschiedlicher Lipide oder Lipidgemische zusammengesetzt werden. Vorgeformte Nanoscheiben sind in der Regel für > 1 Jahr bei -80 °C stabil, während die Stabilität für verschiedene Lipidkomponenten variieren kann. Für das Screening von Lipideffekten auf die Faltung und Stabilität eines MP ist es notwendig, einen umfassenden Satz von Nanoscheiben herzustellen, die mit einer repräsentativen Vielfalt von Lipiden / Lipidmischungen zusammengesetzt sind. Die folgenden Lipide können eine gute Ausgangsauswahl ergeben: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) (DMPG), 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC), 1,2 Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerin) (DOPG), 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC), 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) (POPG) und 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholin (POPC).

Ein Protokoll zur Herstellung einer 3-ml-CECF-Reaktion wird beschrieben. Eine weitere Skalierung nach oben oder unten im Verhältnis 1:1 ist möglich. Für die CECF-Konfiguration mit zwei Kompartimenten muss ein RM hergestellt werden, der alle Verbindungen enthält, und ein FM, der nur die niedermolekularen Verbindungen enthält. Handelsübliche 3-ml-Dialysegeräte mit 10-14 kDa MWCO können als RM-Behälter verwendet werden, die dann in speziell angefertigte Plexiglasbehälter mit dem FM (Abbildung 1D)³⁰ gelegt werden. Das Verhältnis von RM:FM beträgt 1:20, so dass 60 mL FM für 3 mL RM vorbereitet werden müssen. Qualität, Konzentration oder Art mehrerer Komponenten können für die Endausbeute und/oder Qualität des synthetisierten MP entscheidend sein (Tabelle 1). DNA-Templates sollten nach veröffentlichten Richtlinien erstellt werden und die Codon-Optimierung des Leserahmens des Ziels kann die Produktausbeute weiter signifikant verbessern²⁶. Für die CECF-Reaktion im präparativen Maßstab wird ein etabliertes Protokoll für die Herstellung von PR beschrieben. Um Expressionsprotokolle für neue MPs zu erstellen, ist es in der Regel notwendig, Optimierungsscreens bestimmter Verbindungen (Tabelle 1) durchzuführen, um Ausbeute und Qualität zu verbessern. Für Mg²⁺ Ionen existiert ein gut fokussiertes Konzentrationsoptimal, das häufig signifikante Variationen für verschiedene DNA-Templates zeigt. Andere CF-Reaktionsverbindungen wie neue Chargen von T7RNAP oder S30-Lysaten können die optimale^Mg2+ -Konzentration weiter verschieben. Als Beispiel wird ein typischer Mg 2⁺ Bildschirm im Bereich von 14-24 mM Konzentration und in Schritten von 2 mM beschrieben. Jede Konzentration wird in Duplikaten und in analytischen Reaktionen des CECF untersucht. Als CECF-Reaktionsbehälter werden kundenspezifische Mini-CECF-Plexiglasbehälter³⁰ mit dem RM in Kombination mit Standard-24-Well-Mikroplatten verwendet, die das FM enthalten (Abbildung 1B). Alternativ können handelsübliche Dialysekartuschen in Kombination mit 96-tiefen Mikrotiterplatten oder anderen handelsüblichen Dialysatorgeräten in geeigneten Aufbauten verwendet werden (Abbildung 1C).