Membran Proteinlerinin Önceden Oluşturulmuş Nanodisklere Ko-Translasyonel Olarak Yerleştirilmesi

Membran proteinleri (MPS), sulu ortamlarda çözünmemeleri nedeniyle protein üretim çalışmalarında zorlu hedeflerdir. Geleneksel MP üretim platformları, E. coli, maya veya ökaryotik hücreler gibi hücre tabanlı sistemlerden oluşur. Sentezlenen rekombinant milletvekilleri ya hücre zarlarından ekstrakte edilir ya da inklüzyon cisimciklerinden yeniden katlanır¹. Deterjan çözünürlüğünden sonra milletvekilleri, in vitro sulandırma protokolleri oluşturularak uygun membran ortamlarına aktarılabilir. Veziküller ve lipozomların yanı sıra, nanodiskler² veya salipro³ parçacıkları şeklinde düzlemsel membranlara MP resuentasyonu son zamanlarda rutin teknikler haline gelmiştir. Bununla birlikte, tüm bu stratejiler, milletvekilleriyle deterjan temasının istikrarsızlaşmaya, oligomerlerin ayrışmasına ve hatta protein yapısının ve aktivitesinin kaybına neden olabileceği anlamına^{gelir 4}. Bu nedenle optimum deterjan çözünürlüğü ve sulandırma koşullarının taranması sıkıcı ve zaman alıcı olabilir⁵.

Hücresiz (CF) sistemlerin açık doğası, ekspresyon reaksiyonunun, tanımlanmış bir lipit bileşimine sahip önceden oluşturulmuş membranlarla doğrudan sağlanmasını sağlar. Bu lipit bazlı ekspresyon modunda (L-CF), sentezlenmiş milletvekilleri, sağlanan çift katmanlı ^6,7’ye birlikte translasyonel olarak ekleme fırsatına sahiptir (Şekil 1). Düzlemsel lipid çift katmanlı disk^8’i çevreleyen bir membran iskele proteininden (MSP) oluşan nanodiskler, bu strateji ^9,10 için özellikle uygun görünmektedir. Nanodiskler rutin olarak çeşitli farklı lipitlerle in vitro olarak monte edilebilir, çok kararlıdırlar ve stoklar 1 mM’ye kadar konsantre edilebilir. Bununla birlikte, E. coli’de MSP ekspresyonu ve saflaştırılması gereklidir. Alternatif bir strateji olarak MSP, lipozomlarla beslenen KF reaksiyonlarında hedef MP ile birlikte eksprese edilebilir^11,12,13. Hem MSP hem de MP için DNA şablonları reaksiyona eklenir ve ifade üzerine MP / nanodiskler oluşabilir. MSP üretiminden kaçınılırken, birlikte ekspresyon stratejisi, nihai DNA şablon konsantrasyonlarının dikkatli bir şekilde ince ayarlanmasını gerektirir ve numune üretiminin verimliliğinde daha yüksek varyasyonlar beklenebilir.

Milletvekillerinin önceden oluşturulmuş nanodisklerin zarlarına ko-translasyonel olarak eklenmesi, translokon makinelerinden ve sinyal dizileri^{13,14,15,16’dan} bağımsız^, fizyolojik olmayan ve hala büyük ölçüde bilinmeyen bir mekanizmadır. Yerleştirme etkinliğinin başlıca belirleyicileri, membran proteininin tipi ve sağlanan membranın lipit bileşimidir ve negatif yüklü lipitler için sıklıkla tercih edilir^15,17. Nanodisk membranları nispeten sınırlı boyuttadır, MP yerleştirme¹⁸ üzerine önemli miktarda lipit salınır. Nanodisk boyutunun değişimi, daha yüksek oligomerik MP komplekslerinin ^15,18’in yerleştirilmesini ve ayarlanmasını sağlar. Diğerlerinin yanı sıra, iyon kanalı KcsA, iyon pompası proteorhodopsin (PR) ve çoklu ilaç taşıyıcı EmrE^15,18 için homooligomerik komplekslerin doğru montajı gösterilmiştir. Milletvekillerinin simetrik nanodisk membranına her iki taraftan da nispeten eşit frekansta girmeleri muhtemeldir. Bu nedenle, bir nanodiske yerleştirilen farklı monomerlerin veya oligomerlerin zıt yönelimlere sahip olabileceği düşünülmelidir. Bununla birlikte, oryantasyondaki bir önyargı, PR hexamers ve KcsA tetramerlerinin oluşumu için bildirilen işbirlikçi yerleştirme mekanizmalarından kaynaklanabilir¹⁸. MP oryantasyonundaki başka bir önyargı, muhtemelen nanodisk membranlarının kenarına yerleştirilmiş MP’lerin oryantasyon anahtarlarından kaynaklanabilir.

E. coli suşlarından CF lizat üretimi güvenilir bir rutin tekniktir ve hemen hemen her biyokimyasal laboratuvarda gerçekleştirilebilir^19,20. Disülfit köprü oluşumunun yanı sıra, bir MP’nin E. coli lizatları kullanılarak sentezlenmesi durumunda, diğer birçok çeviri sonrası modifikasyonun bulunmadığı düşünülmelidir. Bu, yapısal çalışmalar için daha homojen örnekler üretebilirken, bireysel MP hedeflerinin işlevi üzerindeki potansiyel etkileri dışlamak gerekebilir. Bununla birlikte, E. coli CF lizatlarında G-protein kuplajlı reseptörlerin (GPCR) 14,21,22^, ökaryotik taşıyıcıların 23 veya büyük heteromerik montajların ^24’ünün yüksek kaliteli örneklerinin verimli bir şekilde üretilmesi, karmaşık hedefler için bile uygunluklarını göstermektedir. Bir numunenin hazırlık ölçeği miktarları (≈ 1 mg/mL), bir reaksiyon karışımı (RM) ve bir besleme karışımı (FM) bölmesinden oluşan iki bölmeli sürekli değişim hücresiz (CECF) konfigürasyonu ile elde edilebilir. FM hacmi, RM hacmini 15 ila 20 kat aşıyor ve düşük moleküler ağırlıklı enerji bileşikleri ve öncülleri^19’dan oluşan bir rezervuar sağlıyor. Böylece reaksiyon ifadesi birkaç saat uzatılır ve MP hedefinin nihai verimi artırılır. RM ve FM bölmeleri, 10-14 kDa kesimli bir diyaliz membranı ile ayrılır. İki bölme, CECF reaksiyon kabının özel bir tasarımını gerektirir (Şekil 1). FM’i tutan özel pleksiglas kaplar ile birlikte RM kapları olarak ticari diyaliz kasetleri uygun örneklerdir. MP verimleri, RM: FM oranlarını değiştirerek veya belirli bir inkübasyon süresinden sonra FM’yi değiştirerek daha da manipüle edilebilir.

Bir MP’nin verimi ve kalitesi sıklıkla reaksiyon parametrelerinin yoğun optimizasyonunu gerektirir. CF ifadesinin önemli bir avantajı, bir MP’nin bireysel gereksinimlerine göre hemen hemen her bileşiği değiştirme ve ince ayar yapma olasılığıdır. Basit bir strateji, önce temel bir üretim protokolü oluşturarak bir MP’nin verimini artırmaya odaklanmak ve daha sonra reaksiyon ve katlama koşullarına ince ayar yaparak MP kalitesini optimize etmektir. KF lizatlarında fizyolojik süreçlerin olmaması ve karmaşıklığının azalması, milletvekillerinin verimli üretimi için yüksek başarı oranlarına neden olmaktadır²⁵. DNA şablon tasarımı ve Mg^{2 +} iyon konsantrasyonunun optimizasyonu için rutin hususlar çoğu durumda tatmin edici verimler elde etmek için yeterlidir²⁶. İfade moduna bağlı olarak, MP kalitesinin optimizasyonu zaman alıcı olabilir, çünkü daha çeşitli parametrelerin^{taranması gerekir 14,17,22}.

Tanımlanan CF ekspresyon platformunu oluşturmak için, E. coli CF lizat (i), T7 RNA polimeraz (ii), nanodiskler (iii) ve temel CECF reaksiyon bileşiklerinin (iv) üretimi için protokoller gereklidir (Şekil 1). E. coli K12 suşu A19²⁷ veya BL21 türevleri, verimli S30 (30.000 x g’de santrifüjleme) lizatlarının hazırlanmasında sıklıkla kullanılır. S30 lizatlarının yanı sıra, diğer g-kuvvetlerinde (örneğin S12) santrifüj edilmiş karşılık gelen lizatlar da kullanılabilir. Lisatlar ekspresyon verimliliği ve proteom karmaşıklığı bakımından farklılık gösterir. Tanımlanan protokol ile hazırlanan S30 lizatının proteomu²⁸ ayrıntılı olarak incelenmiştir. S30 proteomu hala iyon kanallarının ekspresyonu ve analizi üzerine arka plan problemleri verebilecek bazı artık dış zar proteinleri içerir. Bu tür hedefler için S80-S100 lizat kullanılması önerilir. Lisat hazırlama sırasında değerli bir modifikasyon, hücrelerin orta log büyüme fazında kombine ısı şoku ve etanol beslemesi ile SOS yanıtının indüklenmesidir. Elde edilen HS30 lizatları şaperonlar bakımından zenginleştirilmiştir ve gelişmiş MP katlama²² için S30 lizatlarla karışımlarda kullanılabilir. E. coli lizatlarındaki CF ekspresyonu, T7 RNA polimeraz (T7RNAP) tarafından kontrol edilen promotörler içeren DNA şablonları ile birleştirilmiş bir transkripsiyon / translasyon işlemi olarak çalıştırılır. Enzim, pAR1219 plazmid^29’u taşıyan BL21 (DE3) Yıldız hücrelerinde verimli bir şekilde üretilebilir.

MSP1E3D1’in iki kopyası, 10-12 nm çapında bir nanodiskte toplanır, ancak aşağıda açıklanan protokol diğer MSP türevleri için de çalışabilir. Bununla birlikte, MSP1E3D1 ile oluşturulanlardan daha büyük nanodiskler daha az kararlı olma eğilimindeyken, MSP1 gibi MSP türevleriyle oluşturulan daha küçük nanodiskler daha büyük MP’leri veya MP komplekslerini barındırmayabilir. MSP1E3D1 nanodiskleri, çok çeşitli farklı lipitler veya lipit karışımları ile in vitro olarak monte edilebilir. Önceden oluşturulmuş nanodiskler genellikle -80 ° C’de 1 yıl > stabildir, stabilite ise farklı lipit bileşenleri için değişebilir. Bir MP’nin katlanması ve stabilitesi üzerindeki lipit etkilerinin taranması için, temsili çeşitli lipitler / lipit karışımları ile monte edilmiş kapsamlı bir nanodisk seti hazırlamak gerekir. Aşağıdaki lipitler iyi bir başlangıç seçimi sağlayabilir: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) (DMPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (DOPG), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) (POPG) ve 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC).

3 mL CECF reaksiyonunun hazırlanması için bir protokol tanımlanmıştır. 1: 1 oranında daha fazla yukarı veya aşağı ölçeklendirme mümkündür. İki bölmeli CECF konfigürasyonu için, tüm bileşikleri içeren bir RM ve sadece düşük moleküler ağırlıklı bileşikleri içeren bir FM hazırlanmalıdır. 10-14 kDa MWCO’lu ticari 3 mL diyaliz cihazları RM konteyner olarak kullanılabilir ve daha sonra FM’i tutan özel yapım pleksiglas kaplara yerleştirilir (Şekil 1D)³⁰. RM: FM oranı 1: 20’dir, bu nedenle 3 mL RM için 60 mL FM hazırlanmalıdır. DNA şablonları yayınlanan kılavuzlara göre hazırlanmalıdır ve hedefin okuma çerçevesinin kodon optimizasyonu ürün verimini daha da artırabilir²⁶. Hazırlık ölçeği CECF reaksiyonu için, PR üretimi için belirlenmiş bir protokol tanımlanmıştır. Yeni milletvekilleri için ifade protokolleri oluşturmak için, verimi ve kaliteyi artırmak için genellikle belirli bileşiklerin optimizasyon ekranlarını (Tablo 1) gerçekleştirmek gerekir. Mg^{2 +} iyonları için, farklı DNA şablonları için sıklıkla önemli varyasyonlar gösteren iyi odaklanmış bir konsantrasyon optimumluğu vardır. Yeni T7RNAP veya S30 lizat partileri gibi diğer CF reaksiyon bileşikleri, optimal Mg^{2 +} konsantrasyonunu daha da değiştirebilir. Örnek olarak, 14-24 mM konsantrasyon aralığında ve 2 mM’lik adımlar halinde tipik bir Mg²⁺ ekran tanımlanmıştır. Her konsantrasyon kopyalar halinde ve analitik ölçekte CECF reaksiyonlarında taranır. CECF reaksiyon kabı olarak, RM’yi tutan özel yapım Mini-CECF Pleksiglas kaplar³⁰, FM’yi tutan standart 24 delikli mikro plakalarla birlikte kullanılır (Şekil 1B). Alternatif olarak, uygun kurulumlarda 96 derin kuyucuklu mikroplakalar veya diğer ticari diyalizör cihazları ile birlikte ticari diyaliz kartuşları kullanılabilir (Şekil 1C).