Co-translationele insertie van membraaneiwitten in voorgevormde nanodiscs

Membraaneiwitten (MPs) zijn uitdagende doelen in eiwitproductiestudies vanwege hun onoplosbaarheid in waterige omgevingen. Conventionele MP-productieplatforms omvatten celgebaseerde systemen zoals E. coli, gist of eukaryote cellen. De gesynthetiseerde recombinante parlementsleden worden ofwel geëxtraheerd uit celmembranen of opnieuw gevouwen uit inclusielichamen¹. Na detergentische oplosbaarheid kunnen parlementsleden worden overgebracht naar geschikte membraanomgevingen door middel van vastgestelde in vitro reconstitutieprotocollen. Naast blaasjes en liposomen zijn MP-reconstitutie in planaire membranen in de vorm van nanodiscs² – of salipro^3-deeltjes de afgelopen tijd routinetechnieken geworden. Al deze strategieën impliceren echter detergentcontact met parlementsleden dat kan leiden tot destabilisatie, dissociatie van oligomeren en zelfs verlies van eiwitstructuur en -activiteit⁴. Screening op optimale oplosbaarheid en reconstitutie van wasmiddelen kan daarom vervelend en tijdrovend zijn⁵.

Het open karakter van celvrije (CF) systemen maakt het mogelijk om de expressiereactie direct te voeden met voorgevormde membranen met een gedefinieerde lipidesamenstelling. In deze lipide-gebaseerde expressiemodus (L-CF) hebben de gesynthetiseerde parlementsleden de mogelijkheid om co-translationeelⁱⁿ te voegen in de geleverde bilayers ^6,7 (figuur 1). Nanodiscs bestaande uit een membraansteigereiwit (MSP) rondom een vlakke lipide bilayer schijf⁸ blijken bijzonder geschikt voor deze strategie ^9,10. Nanodiscs kunnen routinematig in vitro worden geassembleerd met een verscheidenheid aan verschillende lipiden, ze zijn zeer stabiel en voorraden kunnen tot 1 mM worden geconcentreerd. MSP-expressie in E. coli en de zuivering ervan is echter noodzakelijk. Als alternatieve strategie kan MSP samen met de beoogde MP worden uitgedrukt in CF-reacties die worden geleverd met liposomen 11,12,13. DNA-sjablonen voor zowel MSP als MP worden toegevoegd aan de reactie en MP / nanodiscs kunnen zich vormen bij expressie. Hoewel MSP-productie wordt vermeden, vereist de co-expressiestrategie een zorgvuldige verfijning van de uiteindelijke DNA-sjabloonconcentraties en kunnen hogere variaties in de efficiëntie van de monsterproductie worden verwacht.

De co-translationele insertie van parlementsleden in membranen van voorgevormde nanodiscs is een niet-fysiologisch en nog grotendeels onbekend mechanisme dat onafhankelijk is van transloconmachines en signaalsequenties 13,14,15,16. Belangrijke determinanten van de insertie-efficiëntie zijn het type membraaneiwit en de lipidesamenstelling van het geleverde membraan, met een frequente voorkeur voor negatief geladen lipiden ^15,17. Omdat de nanodisc-membranen relatief beperkt zijn in grootte, komt een aanzienlijke hoeveelheid lipiden vrij bij mp-insertie¹⁸. Variatie van nanodisc-grootte maakt het mogelijk om hogere oligomere MP-complexen in te brengen en af te stemmen^15,18. De juiste assemblage van homooligomeercomplexen werd onder andere aangetoond voor het ionkanaal KcsA, voor de ionpomp proteorhodopsine (PR) en voor de multidrugtransporter EmrE^15,18. Kamerleden zullen waarschijnlijk van beide kanten met een relatief gelijke frequentie het symmetrische nanodisc-membraan betreden. Daarom moet ervan worden uitgegaan dat verschillende monomeren of oligomeren die in één nanodisc worden ingebracht, tegengestelde oriëntaties kunnen hebben. Een vertekening in oriëntatie kan echter worden veroorzaakt door coöperatieve insertiemechanismen zoals gerapporteerd voor de vorming van PR-hexameren en KcsA-tetrameren¹⁸. Een verdere vertekening in MP-oriëntatie kan het gevolg zijn van oriëntatieschakelaars van ingebrachte parlementsleden, waarschijnlijk aan de rand van de nanodisc-membranen.

De productie van CF-lysaten uit E. coli-stammen is een betrouwbare routinetechniek en kan in bijna elk biochemisch laboratorium worden uitgevoerd^19,20. Er moet rekening mee worden gehouden dat naast de vorming van disulfidebrug, de meeste andere posttranslationele modificaties afwezig zijn als een MP wordt gesynthetiseerd met behulp van E. coli-lysaten. Hoewel dit meer homogene monsters voor structurele studies kan genereren, kan het nodig zijn om mogelijke effecten op de functie van individuele MP-doelen uit te sluiten. De efficiënte productie van hoogwaardige monsters van G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR)^14,21,22, eukaryote transporters²³ of grote heteromere assemblages²⁴ in E. coli CF-lysaten geeft echter aan dat ze geschikt zijn voor zelfs complexe doelen. Preparatieve schaalhoeveelheden (≈ 1 mg/ml) van een monster kunnen worden verkregen met de cecf-configuratie (continuous exchange cell-free) met twee compartimenten, bestaande uit een reactiemengsel (RM) en een voedingsmengselcompartiment (FM). Het FM-volume overschrijdt het RM-volume 15 tot 20-voudig en biedt een reservoir van laagmoleculaire energieverbindingen en precursoren¹⁹. De expressiereactie wordt dus enkele uren verlengd en de uiteindelijke opbrengst van het MP-doel wordt verhoogd. De RM- en FM-compartimenten worden gescheiden door een dialysemembraan met een cutoff van 10-14 kDa. De twee compartimenten vereisen een speciaal ontwerp van de CECF-reactiecontainer (figuur 1). Commerciële dialysecassettes als RM-containers in combinatie met op maat gemaakte plexiglas containers met de FM zijn geschikte voorbeelden. MP-opbrengsten kunnen verder worden gemanipuleerd door de RM:FM-verhoudingen te wijzigen of door de FM na een bepaalde incubatieperiode uit te wisselen.

Opbrengst en kwaliteit van een MP vereisen vaak een intensieve optimalisatie van de reactieparameters. Een belangrijk voordeel van CF-expressie is de mogelijkheid om bijna elke verbinding te wijzigen en af te stemmen volgens de individuele vereisten van een MP. Een eenvoudige strategie is om je eerst te concentreren op het verbeteren van de opbrengst van een MP door een basisproductieprotocol op te stellen en vervolgens de MP-kwaliteit te optimaliseren door de reactie- en vouwomstandigheden te verfijnen. De afwezigheid van fysiologische processen in CF-lysaten en hun verminderde complexiteit resulteren in hoge slagingspercentages voor de efficiënte productie van parlementsleden²⁵. Routinematige overwegingen voor het ontwerp van DNA-sjablonen en optimalisatie van mg^{2 +} ionenconcentratie zijn in de meeste gevallen voldoende om bevredigende opbrengsten te verkrijgen²⁶. Afhankelijk van de expressiemodus kan optimalisatie van mp-kwaliteit tijdrovend worden, omdat een grotere verscheidenheid aan parameters moet worden gescreend 14,17,22.

Om het beschreven CF-expressieplatform vast te stellen, zijn protocollen nodig voor de productie van E. coli CF-lysaat (i), T7-RNA-polymerase (ii), nanodiscs (iii) en de basis CECF-reactieverbindingen (iv) (figuur 1). De E. coli K12 stam A19²⁷ of BL21 derivaten worden vaak gebruikt voor de bereiding van efficiënte S30 (centrifugatie bij 30.000 x g) lysaten. Naast S30-lysaten mogen overeenkomstige lysaten worden gebruikt die bij andere g-krachten zijn gecentrifugeerd (bv. S12). De lysaten verschillen in expressie-efficiëntie en in proteoomcomplexiteit. Het proteoom van het S30-lysaat, bereid door het beschreven protocol, is in detail bestudeerd²⁸. Het S30-proteoom bevat nog steeds enkele resterende buitenmembraaneiwitten die achtergrondproblemen kunnen geven bij expressie en analyse van ionkanalen. Voor dergelijke doelen wordt het gebruik van S80-S100-lysaten aanbevolen. Een waardevolle wijziging tijdens de lysaatvoorbereiding is de inductie van de SOS-respons door gecombineerde hitteschok- en ethanoltoevoer in de mid-log groeifase van de cellen. De resulterende HS30-lysaten zijn verrijkt met chaperones en kunnen worden gebruikt in mengsels met S30-lysaten voor verbeterde^{MP-vouwing 22}. CF-expressie in E. colilysaten wordt gebruikt als een gekoppeld transcriptie-/translatieproces met DNA-sjablonen die promotors bevatten die worden gecontroleerd door T7-RNA-polymerase (T7RNAP). Het enzym kan efficiënt worden geproduceerd in BL21(DE3) Stercellen die het pAR1219^{plasmide 29} dragen.

Twee kopieën van MSP1E3D1 worden samengevoegd tot één nanodisc met een diameter van 10-12 nm, maar het hieronder beschreven protocol kan ook werken voor andere MSP-derivaten. Nanodiscs groter dan die gevormd met MSP1E3D1 zijn echter meestal minder stabiel, terwijl kleinere nanodiscs gevormd met MSP-derivaten zoals MSP1 mogelijk geen grotere parlementsleden of MP-complexen herbergen. MSP1E3D1 nanodiscs kan in vitro worden geassembleerd met een grote verscheidenheid aan verschillende lipiden of lipidenmengsels. Voorgevormde nanodiscs zijn meestal stabiel voor > 1 jaar bij -80 °C, terwijl de stabiliteit kan variëren voor verschillende lipidecomponenten. Voor de screening van lipide-effecten op vouwen en stabiliteit van een MP, is het noodzakelijk om een uitgebreide set nanodiscs te bereiden die zijn samengesteld met een representatieve verscheidenheid aan lipiden / lipidemengsels. De volgende lipiden kunnen een goede startselectie geven: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1′-rac-glycerol) (DMPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DMPC), 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-fosfo-rac-(1-glycerol) (DOPG), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1′-rac-glycerol) (POPG) en 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholine (POPC).

Een protocol voor de bereiding van een 3 ml CECF-reactie wordt beschreven. Verder omhoog of omlaag schalen in een verhouding van 1:1 is mogelijk. Voor de CECF-configuratie met twee compartimenten moet een RM worden bereid die alle verbindingen bevat en een FM die alleen de verbindingen met een laag molecuulgewicht bevat. Commerciële dialyseapparaten van 3 ml met 10-14 kDa MWCO kunnen worden gebruikt als RM-containers, die vervolgens in op maat gemaakte plexiglascontainers worden geplaatst met de FM (figuur 1D) ³⁰. De verhouding van RM: FM is 1: 20, dus 60 ml FM moet worden voorbereid op 3 ml RM. Kwaliteit, concentratie of type van verschillende componenten kan van cruciaal belang zijn voor de uiteindelijke opbrengst en / of kwaliteit van de gesynthetiseerde MP (tabel 1). DNA-sjablonen moeten worden voorbereid volgens gepubliceerde richtlijnen en codonoptimalisatie van het leesframe van het doelwit kan de productopbrengst verder aanzienlijk verbeteren²⁶. Voor cecf-reactie op preparatieve schaal wordt een vastgesteld protocol voor de productie van PR beschreven. Om expressieprotocollen voor nieuwe parlementsleden op te stellen, is het meestal nodig om optimalisatieschermen van bepaalde verbindingen uit te voeren (tabel 1) om de opbrengst en kwaliteit te verbeteren. Voor Mg²⁺ ionen bestaat een goed gericht concentratieoptimum dat vaak significante variatie vertoont voor verschillende DNA-sjablonen. Andere CF-reactieverbindingen zoals nieuwe partijen T7RNAP- of S30-lysaten kunnen de optimale Mg²⁺ concentratie verder verschuiven. Als voorbeeld wordt een typisch Mg²⁺ scherm binnen het bereik van 14-24 mM concentratie en in stappen van 2 mM beschreven. Elke concentratie wordt gescreend in duplicaten en in CECF-reacties op analytische schaal. Als CECF-reactiecontainer worden op maat gemaakte Mini-CECF-plexiglascontainers³⁰ met de RM gebruikt in combinatie met standaard 24-well microplaten die de FM vasthouden (figuur 1B). Als alternatief kunnen commerciële dialysecartridges in combinatie met 96-diepe putmicroplaten of andere commerciële dialysatorapparaten in geschikte opstellingen worden gebruikt (figuur 1C).