Котрансляционная вставка мембранных белков в предварительно сформированные нанодиски

Мембранные белки (МП) являются сложными мишенями в исследованиях производства белка из-за их нерастворимости в водных средах. Традиционные платформы производства МП включают клеточные системы, такие как E. coli, дрожжи или эукариотические клетки. Синтезированные рекомбинантные МП либо извлекаются из клеточных мембран, либо переворачиваются из тел включения¹. После солюбилизации моющих средств МП могут быть переведены в подходящие мембранные среды с помощью установленных протоколов восстановления in vitro. Помимо везикул и липосом, восстановление MP в плоские мембраны в виде частиц нанодисков² или salipro³ стало обычным методом в последнее время. Однако все эти стратегии подразумевают контакт детергентов с депутатами, что может привести к дестабилизации, диссоциации олигомеров и даже потере структуры и активности белка⁴. Поэтому скрининг на оптимальные условия солюбилизации и восстановления моющих средств может быть утомительным и трудоемким⁵.

Открытая природа бесклеточных (CF) систем позволяет напрямую снабжать реакцию экспрессии предварительно сформированными мембранами с определенным липидным составом. В этом липидном режиме экспрессии (L-CF) синтезированные МП имеют возможность совместного трансляционного введения в предоставленные бислои ^6,7 (рисунок 1). Нанодиски, состоящие из мембранного каркасного белка (MSP), окружающего плоский липидный двухслойный диск⁸, по-видимому, особенно подходят для этой стратегии ^9,10. Нанодиски могут быть обычно собраны in vitro с различными липидами, они очень стабильны, а запасы могут быть сконцентрированы до 1 мМ. Однако экспрессия МПП в кишечной палочке и ее очистка необходимы. В качестве альтернативной стратегии MSP может быть совместно экспрессирован вместе с целевым MP в реакциях CF, поставляемых липосомами 11,12,13. Шаблоны ДНК как для MSP, так и для MP добавляются в реакцию, и MP / нанодиски могут формироваться при экспрессии. В то время как производство МПП избегается, стратегия совместной экспрессии требует тщательной тонкой настройки конечных концентраций шаблона ДНК, и можно ожидать более высоких вариаций эффективности производства образцов.

Котрансляционная вставка МП в мембраны преформированных нанодисков является нефизиологическим и до сих пор в значительной степени неизвестным механизмом, независимым от транслоконных механизмов и сигнальных последовательностей 13,14,15,16. Основными детерминантами эффективности введения являются тип мембранного белка, а также липидный состав предоставленной мембраны, с частым предпочтением отрицательно заряженных липидов^15,17. Поскольку мембраны нанодисков относительно ограничены по размеру, значительное количество липидов высвобождается при вставке^{MP 18}. Изменение размера нанодисков позволяет вставлять и настраивать более высокие олигомерные МП комплексы ^15,18. Среди прочего показана правильная сборка гомолигомерных комплексов для ионного канала KcsA, для ионного насоса протеорходопсина (PR) и для мультилекарственного транспортера EmrE^15,18. Депутаты, скорее всего, войдут в симметричную нанодисковую мембрану с обеих сторон на относительно равной частоте. Поэтому следует учитывать, что различные мономеры или олигомеры, вставленные в один нанодиск, могут иметь противоположные ориентации. Однако смещение в ориентации может быть вызвано механизмами совместной вставки, о которых сообщалось для образования гексамеров PR и тетрамеров KcsA¹⁸. Дальнейшее смещение в ориентации MP может быть результатом переключения ориентации вставленных депутатов, вероятно, на краю мембран нанодисков.

Производство лизатов CF из штаммов E. coli является надежным рутинным методом и может быть выполнено практически в любой биохимической лаборатории ^19,20. Следует учитывать, что помимо образования дисульфидных мостов, большинство других посттрансляционных модификаций отсутствуют, если МП синтезируется с использованием лизатов E. coli. Хотя это может привести к образованию более однородных образцов для структурных исследований, может потребоваться исключить потенциальное воздействие на функцию отдельных мишеней МП. Однако эффективное производство высококачественных образцов рецепторов, связанных с G-белком (GPCR)14,21,22, эукариотических транспортеров ²³ или крупных гетеромерных сборок²⁴ в лизатах E. coli CF, указывает на их пригодность даже для сложных мишеней. Объемы в подготовительной шкале (≈ 1 мг/мл) образца могут быть получены с двухкамерной конфигурацией без ячеек непрерывного обмена (CECF), состоящей из реакционной смеси (RM) и отсека питательной смеси (FM). Объем FM превышает объем RM в 15-20 раз и обеспечивает резервуар низкомолекулярных энергетических соединений и прекурсоров¹⁹. Таким образом, реакция экспрессии растягивается на несколько часов, а конечный выход мишени MP увеличивается. Отсеки RM и FM разделены диализной мембраной с отсечкой 10-14 кДа. Эти два отсека требуют специальной конструкции реакционного контейнера CECF (рисунок 1). Коммерческие диализные кассеты в качестве контейнеров RM в сочетании с индивидуальными контейнерами из плексигласа, содержащими FM, являются подходящими примерами. Доходностью MP можно дополнительно манипулировать, изменяя соотношение RM:FM или обменивая FM после определенного периода инкубации.

Выход и качество МП часто требуют интенсивной оптимизации параметров реакции. Важным преимуществом выражения CF является возможность модификации и тонкой настройки практически любого соединения в соответствии с индивидуальными требованиями MP. Простая стратегия заключается в том, чтобы сначала сосредоточиться на повышении производительности MP путем создания базового производственного протокола, а затем оптимизировать качество MP путем тонкой настройки реакции и условий складывания. Отсутствие физиологических процессов в лизатах муковисцидоза и снижение их сложности приводят к высоким показателям успешности эффективного производства MPs²⁵. Рутинные соображения по проектированию шаблона ДНК и оптимизации концентрации ионов Mg²⁺ в большинстве случаев достаточны для получения удовлетворительных выходов²⁶. В зависимости от режима экспрессии, оптимизация качества MP может занять много времени, так как большее разнообразие параметров необходимо экранировать 14,17,22.

Для создания описанной платформы экспрессии CF необходимы протоколы для производства лизата CF (i), РНК-полимеразы T7 (ii), нанодисков (iii) и основных реакционных соединений CECF (iv) (рисунок 1). Производные штамма E. coli K12 A19²⁷ или BL21 часто используются для получения эффективных лизатов S30 (центрифугирование при 30 000 х г). Помимо лизатов S30, могут использоваться соответствующие лизаты, центрифугированные при других g-силах (например, S12). Лизаты различаются по эффективности экспрессии и сложности протеома. Протеом лизата S30, полученный по описанному протоколу, был детально изучен²⁸. Протеом S30 по-прежнему содержит некоторые остаточные белки наружной мембраны, которые могут создать фоновые проблемы при экспрессии и анализе ионных каналов. Для таких целей рекомендуется использование лизатов S80-S100. Ценной модификацией во время приготовления лизата является индукция реакции SOS комбинированным тепловым шоком и подачей этанола в средней фазе роста клеток. Полученные лизаты HS30 обогащены шаперонами и могут быть использованы в смесях с лизатами S30 для улучшения складывания MP²². Экспрессия CF в лизатах E. coli управляется как связанный процесс транскрипции/трансляции с шаблонами ДНК, содержащими промоторы, контролируемые РНК-полимеразой T7 (T7RNAP). Фермент может быть эффективно продуцирован в звездных клетках BL21(DE3), несущих плазмиду pAR1219²⁹.

Две копии MSP1E3D1 собираются в один нанодиск диаметром 10-12 нм, но протокол, описанный ниже, может работать и для других производных MSP. Тем не менее, нанодиски, большие, чем те, которые сформированы с помощью MSP1E3D1, как правило, менее стабильны, в то время как меньшие нанодиски, сформированные с производными MSP, такими как MSP1, могут не вмещать более крупные MPS или MP-комплексы. Нанодиски MSP1E3D1 могут быть собраны in vitro с большим разнообразием различных липидов или липидных смесей. Предварительно сформированные нанодиски обычно стабильны в течение > 1 года при -80 °C, в то время как стабильность может варьироваться для различных липидных компонентов. Для скрининга липидного воздействия на складчатость и стабильность МП необходимо подготовить комплексный набор нанодисков, собранных с репрезентативным разнообразием липидно-липидных смесей. Следующие липиды могут дать хороший стартовый выбор: 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфо-(1′-рак-глицерин) (DMPG), 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DMPC), 1,2 диолеоил-sn-глицеро-3-фосфо-рак-(1-глицерин) (DOPG), 1,2-диолеоил-sn-глицерон-3-фосфохолин (DOPC), 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфо-(1′-рак-глицерол) (POPG) и 1-пальмитоил-2-олеоил-глицеро-3-фосфохолин (POPC).

Описан протокол приготовления реакции 3 мл CECF. Возможно дальнейшее масштабирование вверх или вниз в соотношении 1:1. Для конфигурации CECF с двумя отсеками необходимо подготовить RM, содержащий все соединения, и FM, содержащий только низкомолекулярные соединения. Коммерческие диализные устройства 3 мл с MWCO 10-14 кДа могут использоваться в качестве контейнеров RM, которые затем помещаются в изготовленные на заказ контейнеры из плексигласа, содержащие FM (рисунок 1D)³⁰. Соотношение RM:FM составляет 1:20, поэтому 60 мл FM должны быть подготовлены для 3 мл RM. Качество, концентрация или тип нескольких компонентов могут иметь решающее значение для конечного выхода и/или качества синтезированного MP (таблица 1). Шаблоны ДНК должны быть подготовлены в соответствии с опубликованными руководящими принципами, и кодонная оптимизация рамки считывания мишени может дополнительно значительно улучшить выход продукта²⁶. Для реакции препаративного масштаба CECF описан установленный протокол получения PR. Для создания протоколов экспрессии для новых депутатов обычно необходимо выполнить оптимизационные экраны определенных соединений (табл. 1) для повышения урожайности и качества. Для ионов Mg²⁺ существует хорошо сфокусированный оптимум концентрации, который часто показывает значительные различия для различных шаблонов ДНК. Другие реакционные соединения CF, такие как новые партии лизатов T7RNAP или S30, могут дополнительно сместить оптимальную концентрацию Mg²⁺ . В качестве примера описан типичный экран Mg²⁺ в диапазоне концентраций 14-24 мМ и с шагом 2 мМ. Каждая концентрация просеивается в дубликатах и в аналитической шкале реакций CECF. В качестве реакционного контейнера CECF используются изготовленные на заказ контейнеры Mini-CECF из оргстекла³⁰ , содержащие RM, в сочетании со стандартными 24-луночными микропластинками, содержащими FM (рисунок 1B). Альтернативно, могут использоваться коммерческие диализные картриджи в сочетании с 96-глубинными микропластинами скважин или другими коммерческими диализаторными устройствами в соответствующих установках (фиг.1С).