Fibrin ile zenginleştirilmiş ve tPA'ya duyarlı fototrombotik inme modeli
Summary
Geleneksel fototrombotik inme (PTS) modelleri esas olarak doku plazminojen aktivatörü (tPA) litik tedavisine karşı yüksek dirençli yoğun trombosit agregatlarını indükler. Burada, fotoaktivasyon için trombin ve ışığa duyarlı boyanın birlikte enjekte edilmesiyle modifiye edilmiş bir murin PTS modeli tanıtıldı. Trombin ile zenginleştirilmiş PTS modeli, karışık trombosit:fibrin pıhtıları üretir ve tPA-trombolizine karşı oldukça hassastır.
Abstract
İdeal bir tromboembolik inme modeli, düşük mortaliteye sahip nispeten basit cerrahi prosedürler, tutarlı bir enfarktüs boyutu ve yeri, trombositin çökelmesi: hastalardakine benzer fibrin karışımlı kan pıhtıları ve fibrinolitik tedaviye yeterli duyarlılık gibi belirli özellikler gerektirir. Gül bengal (RB) boya bazlı fototrombotik inme modeli ilk iki gereksinimi karşılar, ancak muhtemelen trombosit açısından zengin, ancak fibrin açısından fakir pıhtı bileşimi nedeniyle tPA aracılı litik tedaviye oldukça dirençlidir. Orta serebral arterin (MCA) proksimal dalına yönelik fotoaktivasyon için RB boyası (50 mg/kg) ve subtrombotik trombin dozu (80 U/kg) kombinasyonunun fibrin ile zenginleştirilmiş ve tPA’ya duyarlı pıhtılar üretebileceğini düşünüyoruz. Gerçekten de, trombin ve RB (T + RB) kombine fototromboz modeli, immün boyama ve immünoblotlarla gösterildiği gibi karışık trombosit: fibrin kan pıhtılarını tetikledi ve tutarlı enfarktüs boyutları ve konumları ile düşük mortaliteyi korudu. Ayrıca, fotoaktivasyondan sonraki 2 saat içinde intravenöz tPA (Alteplaz, 10 mg/kg) enjeksiyonu, T+RB fototrombozunda enfarktüs boyutunu önemli ölçüde azalttı. Bu nedenle, trombin ile zenginleştirilmiş fototrombotik inme modeli, yeni trombolitik tedavileri test etmek için yararlı bir deneysel model olabilir.
Introduction
Endovasküler trombektomi ve tPA aracılı tromboliz, Amerika Birleşik Devletleri’nde yılda ~ 700.000 hastayı etkileyen akut iskemik inmenin ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) onaylı iki tedavisidir1. Trombektomi uygulaması büyük damar tıkanıklığı (LVO) ile sınırlı olduğundan, tPA-tromboliz küçük damar tıkanıklıklarını hafifletebildiğinden, her ikisi de akut iskemik inme için değerli tedavilerdir2. Ayrıca, her iki tedavinin kombinasyonu (ör., inme başlangıcından sonraki 4.5 saat içinde tPA-trombolizin başlatılması, ardından trombektomi) reperfüzyonu ve fonksiyonel sonuçları iyileştirir3. Bu nedenle, trombolizi optimize etmek, trombektomi çağında bile inme araştırmaları için önemli bir hedef olmaya devam etmektedir.
Tromboembolik modeller, trombolitik tedavileri iyileştirmeyi amaçlayan klinik öncesi inme araştırmaları için önemli bir araçtır. Bunun nedeni, mekanik vasküler oklüzyon modellerinin (örneğin, intraluminal sütür MCA oklüzyonu) kan pıhtıları üretmemesi ve mekanik oklüzyonun çıkarılmasından sonra serebral kan akışının hızlı bir şekilde geri kazanılmasının aşırı derecede idealize edilmesidir 4,5. Bugüne kadar, başlıca tromboembolik modeller arasında fototromboz 6,7,8, topikal ferrik klorür (FeCl3) uygulaması9, MCA dalına trombin mikroenjeksiyonu10,11, MCA veya ortak karotis artere (CCA) ex vivo (mikro) emboli enjeksiyonu12,13,14 ve geçici hipoksi-iskemi (tHI)15,16, 17,18. Bu inme modelleri, takip eden pıhtıların histolojik bileşimi ve tPA aracılı litik tedavilere duyarlılık açısından farklılık gösterir (Tablo 1). Ayrıca kraniotominin cerrahi gereksinimi (in situ trombin enjeksiyonu ve FeCl3’ün topikal uygulaması için gereklidir), enfarktüs boyutunun ve yerinin tutarlılığı (ör., mikroembolinin CCA infüzyonu çok değişken sonuçlar verir) ve kardiyovasküler sistem üzerindeki küresel etkiler (örneğin, tHI, hipoksi kaynaklı periferik vazodilatasyonu telafi etmek için kalp atış hızını ve kalp debisini arttırır).
RB boya bazlı fototrombotik inme (PTS) modeli, basit kraniyotomi içermeyen cerrahi prosedürler, düşük mortalite (tipik olarak %5′<) ve öngörülebilir bir enfarktüs boyutu ve yeri (MCA sağlayan bölgede) dahil olmak üzere birçok çekici özelliğe sahiptir, ancak iki ana sınırlaması vardır. 8 İlk uyarı, aynı zamanda FeCl3 modeli 7,19,20’nin bir dezavantajı olan tPA aracılı trombolitik tedaviye zayıftan sıfıra yanıttır. PTS ve FeCl3 inme modellerinin ikinci uyarısı, takip eden trombüslerin az miktarda fibrin içeren yoğun paketlenmiş trombosit agregatlarından oluşmasıdır, bu sadece tPA-litik tedaviye karşı direncine yol açmakla kalmaz, aynı zamanda akut iskemik inme hastalarında karıştırılmış trombosit:fibrin trombüs modelinden de sapar21,22. Buna karşılık, in situ trombin-mikroenjeksiyon modeli esas olarak polimerize fibrin ve belirsiz bir trombosit içeriğiiçerir 10.
Yukarıdaki mantık göz önüne alındığında, inceltilmiş kafatası yoluyla MCA hedefli fotoaktivasyon için RB ve sub-trombotik trombin dozunun karışımının, ortaya çıkan trombüsteki fibrin bileşenini artırabileceğini ve tPA aracılı litik tedaviye duyarlılığı artırabileceğini varsaydık. Bu hipotezi doğruladık,23 ve burada modifiye (T+RB) fototrombotik inme modelinin ayrıntılı prosedürlerini açıklıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
1985 yılında tanıtılan geleneksel RB fototrombotik inme, basit cerrahi prosedürler, düşük mortalite ve beyin enfarktüsünün yüksek tekrarlanabilirliği için çekici bir fokal serebral iskemi modelidir. 5 Bu modelde, fotodinamik boya RB, ışık uyarımı üzerine trombositleri hızla aktive eder ve kan damarını tıkayan yoğun agregalara yol açar 5,8,23. Bununla birlikte, RB ile indüklenen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH hibeleri (NS108763, NS100419, NS095064 ve HD080429’den C.Y.K.’ye; NS106592 Y.Y.S.’ye) desteklenmiştir.
Materials
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | infarct |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 543nm laser beam | Melles Griot | 25-LGP-193-249 | photothrombosis |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~14 weeks old (22~30 g) |
| Anesthesia bar for mouse adaptor | machine shop, UVA | surgical setup | |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Dental drill | Dentamerica | Rotex 782 | surgical setup |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | brain imaging |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| infusion pump | KD Scientific | 200 | thrombolytic treatment |
| Insulin syringe with 31G needle | BD | 328291 | photothrombosis |
| Ketamine | CCM, UVA | anesthesia | |
| Laser protective google 532nm | Thorlabs | LG3 | photothrombosis |
| Meloxicam SR | CCM, UVA | NSAID analgesia | |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mouse adaptor | RWD | 68014 | surgical setup |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| Retractor tips | Kent Scientific | Surgi-5014-2 | surgical setup |
| Rose Bengal | Sigma | 198250 | photothrombosis |
| Thrombin | Sigma | T7513 | photothrombosis |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| tPA | Genetech | Cathflo activase 2mg | thrombolytic treatment |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | TTC infacrt |
| Xylazine | CCM, UVA | anesthesia |
References
- Lyden, P. D. . Thrombolytic Therapy for Acute Stroke. 3/e. , (2015).
- Linfante, I., Cipolla, M. J. Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy. Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).
- Campbell, B. C., et al. Endovascular Therapy for Ischemic stroke with perfusion-imaging selection. The New England Journal of Medicine. 372 (11), 1009-1018 (2015).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (7), 1310-1316 (2012).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
- Watson, B. D., Prado, R., Veloso, A., Brunschwig, J. P., Dietrich, W. D. Cerebral blood flow restoration and reperfusion injury after ultraviolet laser-facilitated middle cerebral artery recanalization in rat thrombotic stroke. Stroke. 33 (2), 428-434 (2002).
- Uzdensky, A. B. Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke. Translational Stroke Research. 9 (5), 437-451 (2018).
- Karatas, H., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (3), 1452-1460 (2011).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Orset, C., et al. Efficacy of Alteplase in a mouse model of acute ischemic stroke: A retrospective pooled analysis. Stroke. 47 (5), 1312-1318 (2016).
- Kudo, M., Aoyama, A., Ichimori, S., Fukunaga, N. An animal model of cerebral infarction. Homologous blood clot emboli in rats. Stroke. 13 (4), 505-508 (1982).
- Busch, E., Kruger, K., Hossmann, K. A. Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat. Brain Research. 778 (1), 16-24 (1997).
- Lapchak, P. A., Araujo, D. M., Zivin, J. A. Comparison of Tenecteplase with Alteplase on clinical rating scores following small clot embolic strokes in rabbits. Experimental Neurology. 185 (1), 154-159 (2004).
- Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-Edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9 (6), 98807 (2014).
- Sun, Y. Y., et al. Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: Implications for perioperative neuroprotection. Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).
- Sun, Y. Y., et al. Sickle mice are sensitive to hypoxia/ischemia-induced stroke but respond to tissue-type plasminogen activator treatment. Stroke. 48 (12), 3347-3355 (2017).
- Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. A thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxia-ischemia. Journal of Visualized Experiments. (102), e52978 (2015).
- Pena-Martinez, C., et al. Pharmacological modulation of neutrophil extracellular traps reverses thrombotic stroke tPA (tissue-type plasminogen activator) resistance. Stroke. 50 (11), 3228-3237 (2019).
- Denorme, F., et al. ADAMTS13-mediated thrombolysis of t-PA-resistant occlusions in ischemic stroke in mice. Blood. 127 (19), 2337-2345 (2016).
- Marder, V. J., et al. Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke. Stroke. 37 (8), 2086-2093 (2006).
- Bacigaluppi, M., Semerano, A., Gullotta, G. S., Strambo, D. Insights from thrombi retrieved in stroke due to large vessel occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (8), 1433-1451 (2019).
- Sun, Y. Y., et al. A murine photothrombotic stroke model with an increased fibrin content and improved responses to tPA-lytic treatment. Blood Advances. 4 (7), 1222-1231 (2020).
- Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nature Medicine. 14 (7), 731-737 (2008).
- Gupta, A. K., et al. Protective effects of gelsolin in acute pulmonary thromboembolism and thrombosis in the carotid artery of mice. PLoS One. 14 (4), 0215717 (2019).
- Carroll, B. J., Piazza, G. Hypercoagulable states in arterial and venous thrombosis: When, how, and who to test. Vascular Medicine. 23 (4), 388-399 (2018).
- Coutts, S. B., Berge, E., Campbell, B. C., Muir, K. W., Parsons, M. W. Tenecteplase for the treatment of acute ischemic stroke: A review of completed and ongoing randomized controlled trials. International Journal of Stroke. 13 (9), 885-892 (2018).
- McFadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis. Nature Reviews Cardiology. 15 (3), 181-191 (2018).
- Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies. Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).
- Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. A brief etymology of the collateral circulation. Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).
